血清microRNA-1、LASP1、TAGLN2及LGALS3BP在食管癌診斷中的價值

白云鵬 劉洋 范曉溪

作者單位：110001 沈陽 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科

2018年，食管癌新發(fā)病例57萬余例，死亡病例超50萬例，發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別排第七位和第六位［1］。食管癌發(fā)病隱匿，預后較差，發(fā)現(xiàn)時已處于晚期或已發(fā)生了區(qū)域性、遠端轉移［2］。因此尋找食管癌早期診斷的生物標志物十分必要。多項研究表明，microRNA-1、肌動蛋白骨架蛋白 1（LASP1）、肌動蛋白結合蛋白2（TAGLN2）和半乳糖凝集素-3結合蛋白（LGALS3BP）均與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和發(fā)展有關［3-6］。此外，在膀胱癌和食管癌細胞中LASP1和TAGLN2表達水平與microRNA-1表達水平呈負相關［7-8］，在宮頸癌細胞中LGALS3BP表達水平與microRNA-1表達水平呈負相關［9］，一項關于食管癌患者的臨床研究，發(fā)現(xiàn)食管癌患者血清中LGALS3BP表達水平升高［10］。因此，本研究檢測食管癌患者以及健康對照者血清中microRNA-1和LASP1、TAGLN2及LGALS3BP的表達水平，并分析其在食管癌中的診斷價值，旨在為食管癌的早期診斷提供理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2012年1月至2016年1月在沈陽某三甲醫(yī)院收治的128例食管癌患者作為觀察組。所有患者均經(jīng)病理確診為食管鱗狀細胞癌，在搜集血液樣本前未進行任何方式的治療（如手術、放療和化療），排除合并其他部位腫瘤的患者。其中男性73例，女性55例；年齡（62.3±14.5）歲；腫瘤 TNM 臨床分期（2009年，第七版）：Ⅰ期33例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期32例。選擇同期在該院體檢的134名健康者作為對照組，其中男性69例，女性65例；年齡（63.6±12.3）歲。性別、年齡、體重、吸煙史、飲酒史及食管癌家族史等在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2012-32-2），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

LASP1、TAGLN2和LGALS3BP酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒分別購自美國GenWay公司、LifeSpanBioSciences公司和Abcam公司；microRNA-1以及內參基因U6引物、microRNA提取試劑盒、microRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒和microRNA熒光定量PCR試劑盒購自生物工程（上海）股份有限公司；全波長酶標儀購自美國BioTek公司；7500 Real-time PCR儀購自美國ABI公司。

表1 兩組人群一般資料比較Tab.1 Comparison of general personal data between two groups

1.3 血清樣本采集

所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血5 mL，室溫靜置15～20 min，1 500 r/min 離心 15 min，吸取上層淡黃色血清并分裝成兩管，-80℃保存，分別用于測定血清中 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 及 microRNA-1的表達水平。

1.4 ELISA實驗檢測血清中 LASP1、TAGLN2和LGALS3BP蛋白的表達水平

采用抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP單抗分別包被酶標板，將標準品和樣品中的LASP1、TAGLN2和LGALS3BP與單抗結合，加入生物素化的抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP抗體形成免疫復合物連接，與板上辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素與生物素結合。加入酶底物工作液，出現(xiàn)藍色后加入終止液。最后采用BioTek Epoch全波長酶標儀測定光密度值，通過繪制標準曲線求出樣品中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的濃度。

1.5 PCR實驗檢測血清中microRNA-1 mRNA的表達水平

取100 μL血清，應用microRNA提取試劑盒提取血清中microRNA，參照miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒說明書進行操作，總反應體系為20 μL，包括 2 × miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL、microRNA 100 ng，補充 RNase-free water至20 μL。逆轉錄反應條件為37℃60 min，85℃5 min，轉錄后cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

應用microRNA熒光定量PCR試劑盒以逆轉錄的cDNA為模板，在7500 Real-time PCR儀上進行熒光定量PCR實驗檢測血清中microRNA-1的表達。microRNA-1序列：上游引物為5′-CTCGACAAACGTCTAAATGCT-3′，下游引物為 5′-CAGTGGAGCTGGAATGTAAAGAA-3′；內參基因 U6 序列：上游引物為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應總體積為20 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，2×miRNA qPCR master mix 10 μL，上下游引物分別為 0.5 μL，RNase-free water 7 μL。反應條件：預變性95℃ 30 s；變性95℃5 s；退火/延伸60℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應結束后采用2-△△Ct法計算microRNA-1的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，并進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（χ±s）來表示，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗；計數(shù)資料以構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析分別檢測LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1相關性。采用ROC曲線分析microRNA-1、LASP1、TAGLN2及LGALS3B對食管癌的診斷價值，采用Logistic回歸結合ROC曲線分析上述4個指標的聯(lián)合診斷價值，通過ROC曲線下面積（AUC）評價不同指標的診斷效能。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP及microRNA-1表達水平比較

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；但microRNA-1 mRNA表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見表2。

2.2 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1的相關性

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1的表達水平均呈負相關，相關系數(shù)依次為-0.713（95%CI：-0.789～-0.616）、-0.667（95%CI：-0.753～-0.558）和-0.722（95%CI：-0.796～-0.627）。見圖1。

表2 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1表達水平比較（χ±s）Tab.2 Comparison of the Expression levels of LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum（χ±s）

圖1 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1表達的相關性Fig.1 The correlation between LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum of esophageal cancer patients

2.3 microRNA-1、LASP1、TAGLN2及 LGALS3B 表達水平對食管癌的診斷價值

microRNA-1、LASP1、TAGLN2 和 LGALS3BP 的AUC 分別為 0.940（95%CI：0.913～0.967）、0.890（95%CI：0.843～0.936）、0.841（95%CI：0.794～0.889）和 0.924（95%CI：0.893～0.956）。為了進一步提高對食管癌診斷的準確性，本研究綜合上述4個指標對食管癌進行聯(lián)合診斷，聯(lián)合診斷的 AUC 為 0.970（95%CI：0.954～0.987），均高于單個指標的AUC（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達水平單獨以及聯(lián)合診斷食管癌ROC曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP expression alone and combined diagnosis of esophageal cancer

圖 2microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 單獨及聯(lián)合診斷食管癌的ROC曲線Fig.2ROC curve of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP alone and combined diagnosis of esophageal cancer

3 討論

目前食管癌的診斷主要依靠內鏡活檢，但價格相對較高，且可能對患者造成一定的創(chuàng)傷。近年來，針對血清中腫瘤相關標志物的檢測和研究成為食管癌早期診斷的一種新的途徑［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表達水平高于對照組，microRNA-1mRNA表達水平低于對照組，且LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達水平與microRNA-1表達水平均呈負相關。提示microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達水平可能對食管癌的診斷有一定的價值。

microRNA是由長度為20～22個堿基組成的非編碼小分子RNA，在腫瘤增殖、遷移和凋亡等均有重要的生物學作用［11］。microRNA可作為生物標志物對多種疾?。ㄓ绕涫悄[瘤）具有診斷價值，目前血液中有超過100種不同的microRNA被發(fā)現(xiàn)，且可用于多種類型腫瘤診斷［11］。文獻報道，microRNA-1與食管癌的發(fā)展和預后相關，在食管癌中microRNA-1表達下調，發(fā)揮抑癌基因的作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者血清中microRNA-1表達顯著下調，與上述文獻報道的結果一致。同時ROC曲線分析顯示microRNA-1對食管癌的AUC為0.940，靈敏度和特異度分別為92.19%、84.33%，說明microRNA-1在食管癌的診斷中靈敏度較好，但是特異度稍差。

LASP1是一類肌動蛋白結合蛋白，與乳腺癌的發(fā)展和轉移有關［12］，且其在卵巢癌、肝癌中表達上調［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中 LASP1水平高于對照組，應用ROC曲線分析LASP1對食管癌的診斷價值，結果顯示AUC為0.890，靈敏度和特異度分別為81.25%、99.25%，說明LASP1對食管癌的診斷中靈敏度較差，但是有很高的特異度。

TAGLN2是鈣結合蛋白家族成員，主要參與細胞分化、黏附和遷移，TAGLN2在膀胱癌表達異常［7］。本研究中食管癌患者血清中TAGLN2水平明顯升高。ROC曲線分析顯示，AUC為0.841，靈敏度和特異度分別為88.28%、70.15%，提示TAGLN2作為食管癌診斷的標志物具有一定的應用價值，但其特異度并不高。

LGALS3BP是一類分子量約為90 kDa的糖蛋白，與巨噬細胞凝集素、Mac 2和富含半胱氨酸的巨噬細胞受體結構域成員有關，LGALS3BP可上調腫瘤細胞中黏附分子的表達［15］，其在肺癌和前列腺癌中表達上調［16-17］。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，LGALS3BP在食管癌患者血清中表達水平顯著升高［9］，本研究亦顯示其在食管癌患者血清中表達升高。ROC曲線分析顯示，AUC為0.924，靈敏度和特異度分別為80.47%、100%，說明LGALS3BP作為食管癌診斷的血清學標志物，其特異度很高，但是靈敏度上稍弱。

在應用上述指標對食管癌單獨診斷的基礎上，本研究進一步分析了上述指標聯(lián)合診斷食管癌的價值，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷的AUC明顯高于各個指標的單獨診斷，聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度均達到了90%以上，說明在食管癌的診斷中，多指標聯(lián)合的診斷價值要優(yōu)于單獨指標診斷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1對食管癌具有一定的診斷價值，此外血清 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1聯(lián)合診斷食管癌的診斷價值要高于單獨指標診斷，且 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 與microRNA-1表達水平呈負相關，但microRNA-1是否可以負向調節(jié)血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP水平仍需進一步的研究證實。