琴葉榕根提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用

丘建媚　李菲菲　溫正輝　巫金高　莊遠(yuǎn)杯　張聲源

【摘 要】 目的：研究琴葉榕根2種提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用。方法：采用超聲輔助提取法制備琴葉榕根乙醇提取物，回流提取法制備琴葉榕根水提取物。以pNPG （對-硝基苯基- α-D -吡喃葡萄糖苷）和可溶性淀粉為底物分別測定琴葉榕根提取物對 α-葡萄糖苷酶（酵母來源和小鼠小腸來源）和α-淀粉酶活性的影響。結(jié)果：琴葉榕根乙醇提取物和水提取物均具有較好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，其對酵母菌源α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為：（128.13±3.28）、（1923.45±3.24） μg/mL; 對小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為：（531.04±5.72）、（2232.27±5.76） μg/mL;對α -淀粉酶的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為：（714.25±4.37）、（1141.28±1.23） μg/mL。結(jié)論：琴葉榕根乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶均強(qiáng)于水提取物，有作為新型α-葡萄糖苷酶抑制劑開發(fā)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 琴葉榕;α-葡萄糖苷酶;α-淀粉酶

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）14-0026-04

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是繼腫瘤、心腦血管疾病之后的嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病，為全球性公共衛(wèi)生難題[1]。目前，臨床治療糖尿病主要采用化學(xué)藥物療法，但其有效率僅有70%，且長期連續(xù)服藥會(huì)出現(xiàn)耐藥、胃腸道反應(yīng)和肝臟損害等不良反應(yīng)[2-3]。且2型糖尿病由于胰島素分泌不足及分泌高峰延遲，餐后血糖持續(xù)升高，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮損傷、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥[4]。因此，有效控制餐后血糖上升是防治糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生的重要途徑之一。 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是碳水化合物消化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，為降低餐后血糖的有效分子靶標(biāo)[5]，目前臨床上廣泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖，存在胃腸道反應(yīng)[6]。從傳統(tǒng)中草藥中篩選新型的、安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為研究熱點(diǎn)。

琴葉榕為?？崎艑偾偃~榕Ficus pandurata Hance，又稱為牛奶樹根、牛奶子，主要分布于廣東、廣西、江西等地[7-8]，具有清熱、健脾開胃、溢氣生津、祛濕化滯等功效，用于祛風(fēng)、去濕、解毒、通乳等[8]。在梅州地區(qū)民間常用琴葉榕的根制作藥膳，用于腰背酸痛、糖尿病、風(fēng)濕病等的輔助治療，但其藥用及食用的科學(xué)內(nèi)涵至今尚未明確，嚴(yán)重制約了琴葉榕根的開發(fā)利用[8-9]。實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶為靶標(biāo)，對琴葉榕根醇提取物和水提取物進(jìn)行體外降血糖活性的比較研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試藥 藥材琴葉榕根于2017年5月采購于廣東省梅州市梅江區(qū)美苑市場，經(jīng)筆者丘建媚主管中藥師鑒定為?？崎艑偾偃~榕（Ficus pandurata Hance）的根部。

1.2 試劑 酵母來源α-葡萄糖苷酶 （α-glucosidase，批號：SLBT8587，美國 Sigma 公司）; α-淀粉酶（α-amylase，批號：SLBV0705，美國sigma 公司）;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 （4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，批號：K26J8B39810 ，上海源葉科技有限公司）;3，5二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，批號：20170904，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;阿卡波糖（Acarbose，批號：BJ41706，德國拜耳有限公司）;甲醇和乙腈腈（色譜純，fisher scientific 公司）;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 Alliance2695型高效液相色譜儀（沃特世科技（上海）有限公司）;UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）;MING-CHE 24ΜV型純水儀（法國Merck Millipore公司）;N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）;PB-21型pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康昆明種小鼠（由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號：SCXK（粵）2018-0002），體重18～22g。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 琴葉榕根提取物的制備 琴葉榕根干品1.0kg，粉碎，加入適量超純水，回流提取2h，提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根水提取物（73.47g），備用。

琴葉榕根干品1.0kg，粉碎，加入適量的95%乙醇，浸泡12h，超聲輔助提?。?5℃，200W，60min）三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根乙醇提取物（90.42g），備用。

2.2 酶溶液的制備

2.2.1 酵母來源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液（67mmol/L，pH 6.8）溶解并定容于100mL容量瓶，即得1.0U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1U/mL。

2.2.2 小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行提取，采用頸椎脫位的方法處死小鼠，獲得小鼠小腸。分別采用4 ℃預(yù)冷的0.9% NaCl溶液和10mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）清洗腸道脂肪組織，縱向切開，洗凈內(nèi)容物，在濾紙上吸干，用剪刀剪碎后分別放入10mL離心管中，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鈉緩沖液稀釋，置勻漿機(jī)勻漿，后于4 ℃下8000r/min離心20 min，吸取上清液于10mL離心管中，即得鼠源α-葡萄糖苷酶，-20 ℃冰箱貯存以備用，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1U/mL。

2.2.3 α-淀粉酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液（67mmol/L，pH 6.8）溶解并定容于1000mL容量瓶，即得500.0U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至3.75U/mL。

2.3 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 琴葉榕提取物對酵母來源和小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[11]方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體如下：將67mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液250μL、待測樣品50μL（4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0μg/mL）、0.1U/mL α-葡萄糖苷酶 300μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育 20min，加入4.0mmol/L pNPG 200μL，振蕩混勻，37℃恒溫反應(yīng) 30min 后，加入碳酸鈉800μL 終止反應(yīng)，經(jīng)0.45μm 膜過濾后，采用 HPLC 檢測，按公式（1）計(jì)算對 α-葡萄糖苷酶的抑制率。阿卡波糖作為陽性對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率%=（A0-Ai+Aj）/A0×100%公式（1）

注：A0 為緩沖液+酶液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度;Ai：樣品+酶液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度;Aj：樣品+緩沖液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度。

2.4 色譜條件 色譜柱：XBridge Peptide BEH C18 柱（5μm，4.6mm×250mm）;流動(dòng)相： 乙腈（A）～0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫條件：0～8min，20%～30% A;8～13min，30%～80% A;13～15min，80%～20% A;15～25min，20% A。流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：35℃;檢測波長315nm。

2.5 對α-淀粉酶的抑制活性 參考文獻(xiàn)[12]，在反應(yīng)體系中分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.3mL（4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0μg/mL），取0.3mL α-淀粉酶溶液分別與樣品混合均勻，置于37℃水浴中預(yù)溫5min，加入0.3mL在37℃水浴中同時(shí)預(yù)溫5min的1%可溶性淀粉溶液，混勻后反應(yīng)15min，立即加入0.5mL DNS顯色并終止反應(yīng)，置于沸水中煮沸5min，隨后放置于冰水中靜置20min，磷酸緩沖溶液定容至5mL，在540nm下測吸光值，按公式（2）求得 α-淀粉酶的抑制活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對照為阿卡波糖，空白對照為不加樣品和酶液，空白組不加樣品，背景對照為對應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品及底物溶液（不加酶液和樣品以緩沖液補(bǔ)足）。

2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件進(jìn)行處理，以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 在α-葡萄糖苷酶的作用下，底物pNPG的糖苷鍵斷裂，水解成的亮黃色物質(zhì)對硝基苯酚（pNP），pNP在315nm有最大吸收，可通過高效液相色譜（HPLC）紫外檢測器測定水解生成pNP的量。

3.1.1 精密度試驗(yàn) 在無抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，同一份樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)6次的pNP峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.42%（n=6），表明HPLC精密度良好。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在無抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，同一份樣品，分別于0、2、6、12、24h進(jìn)行測定，結(jié)果顯示pNP峰面積的RSD值為0. 60%，表明pNP在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)：在無抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)6次的pNP峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.93%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

3.1.4 對α-葡萄糖苷酶的抑制率測定 由圖1可知，無抑制時(shí)的pNPG和pNP色譜峰保留時(shí)間分別為4.99min、11.96min。此外，為考察提取物對pNPG和pNP的保留時(shí)間、峰型是否有影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)不加酶溶液的實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，琴葉榕提取物對pNPG保留時(shí)間、峰型不產(chǎn)生影響。此外，在11.96min也未檢測到峰，說明琴葉榕提取物在11.96min沒有吸收，對pNP含量的檢測無影響，同時(shí)也表明琴葉榕提取物不會(huì)使底物pNPG分解產(chǎn)生pNP，可避免假陽性實(shí)驗(yàn)的發(fā)生。

α-葡萄糖苷酶在抑制劑的作用下，隨抑制劑質(zhì)量濃度的增大，其催化pNPG水解生成pNP的量減少，結(jié)果見圖3（以琴葉榕醇提取物對酵母來源α-葡萄糖苷酶的影響為例，其余相同）。圖中pNP（tR=11.96min）峰面積由小到大對應(yīng)的琴葉榕醇提取物質(zhì)量濃度依次為4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0μg/mL，表明隨琴葉榕醇提取物質(zhì)量濃度的增大，酶抑制效果越強(qiáng)。

琴葉榕根乙醇提取物抑制酵母來源和小鼠小腸來源 α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為（128.13±3.28）μg/mL、（531.04±5.72）μg/mL，均顯著低于水提取物（見表1），提示琴葉榕根乙醇提取物對 α-葡萄糖苷酶的抑制活性強(qiáng)于水提取物。

3.2 對α-淀粉酶的抑制活性 琴葉榕根乙醇提取物對α-淀粉酶的IC50值為（714.25±4.37）μg/mL，顯著低于水提取物（1141.28±1.23）μg/mL（P<0.05），提示琴葉榕根乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制活性強(qiáng)于水提取物（見表1）。

4 討論與結(jié)論

琴葉榕在客家地區(qū)常作滋補(bǔ)湯料，配以龍骨、雞肉煲湯，用于祛濕、降糖等。據(jù)《江西民間草藥驗(yàn)方》、《福建中草藥》等客家地區(qū)經(jīng)典著作記載，牛奶樹根祛風(fēng)除濕、清熱解毒、活血行氣、舒經(jīng)通絡(luò)等功效明顯[13]。琴葉榕藥用和食用價(jià)值高，市場經(jīng)濟(jì)價(jià)值潛力巨大，但其現(xiàn)代藥學(xué)研究薄弱。實(shí)驗(yàn)以琴葉榕根為研究對象，對其醇提取物和水提取物進(jìn)行降血糖活性評價(jià)，并進(jìn)行活性差異的比較研究，結(jié)果表明，琴葉榕根乙醇提取物和水提取物對兩種來源α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有顯著的抑制活性，其中乙醇提取物抑制活性強(qiáng)于水提取物。結(jié)果提示應(yīng)聚焦于琴葉榕根乙醇提取物，并對其進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分、藥理活性研究，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制，推動(dòng)琴葉榕的進(jìn)一步開發(fā)利用。

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（收稿日期：2019-04-24 編輯：程鵬飛）