HPLC法測(cè)定大鼠血漿華法林及紅參對(duì)華法林抗凝作用的影響

張瑜　鄭宓　張寬　陳明　鄢琳　葉華　李雪　賴文婷

【摘 要】 目的：建立和優(yōu)化HPLC法測(cè)定大鼠血漿華法林濃度，并觀察紅參對(duì)大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的影響，探討兩者是否存在藥物相互作用，為臨床合理用藥提供參考。方法：建立HPLC法測(cè)定大鼠血漿華法林濃度，以乙腈∶乙酸水（1%）=70∶30為流動(dòng)相，等度洗脫。流速為1mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)308nm，進(jìn)樣量為20μL。全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)血漿PT，計(jì)算INR，從而觀察紅參對(duì)華法林抗凝作用的影響。結(jié)果：華法林血漿濃度在1.007～50.35μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。低、中、高3種濃度的華法林血漿樣品提取回收率為85.17%～95.29%，方法回收率分別為97.44%～109.3%，日間、日內(nèi)RSD均小于10%。同服組和預(yù)服組較華法林組的PT值和INR值均有不同程度的延長(zhǎng)，其中預(yù)服組在D7和D10時(shí)PT值和INR值升高具有顯著性差異，但兩組較華法林組的血藥濃度均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：HPLC法能準(zhǔn)確、精密、快速、穩(wěn)定地檢測(cè)華法林的血藥濃度，可用于紅參與華法林藥物相互作用的研究中測(cè)定大鼠血漿中華法林濃度。紅參可能增強(qiáng)華法林抗凝效果，增加出血風(fēng)險(xiǎn)，推測(cè)與其抑制華法林代謝有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 紅參;華法林;HPLC;相互作用

【中圖分類號(hào)】285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）14-0017-05

華法林（warfarin）是口服香豆素類抗凝藥，廣泛應(yīng)用于機(jī)械瓣膜置換術(shù)、血栓栓塞性疾病、心房顫動(dòng)[1]。但華法林在臨床使用過(guò)程中存在治療窗窄及藥物相互作用復(fù)雜的問(wèn)題，使其臨床療效和不良反應(yīng)個(gè)體差異大，劑量難以掌握，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)的現(xiàn)狀為阿司匹林應(yīng)用較普及，而華法林的應(yīng)用率較低，僅為2.5%～3%[2]。據(jù)報(bào)道[3]，約40%的心血管疾病和腦卒中患者均合并使用中藥。由于中藥通常含有多種藥理活性成分，與成分單一的西藥相比，中藥與華法林產(chǎn)生藥物相互作用的可能性更高。近年來(lái)，中藥對(duì)華法林抗凝作用的影響也越來(lái)越受到臨床的重視。其中人參、西洋參與華法林的相互作用的研究較多[4]。紅參是人參的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖。但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見紅參與華法林相互作用實(shí)驗(yàn)研究的相關(guān)報(bào)道。筆者旨在通過(guò)建立高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定大鼠血漿華法林的血藥濃度并初步探討紅參與華法林是否存在藥物相互作用，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）;PDA-100 Photodiode Array;AcclaimTM120 C18（250×4.6mm，5μm）色譜柱;XY系列精密電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;HC-2062高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;CS-2000i全自動(dòng)凝血分析儀 （希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司）。

1.2 藥品與試劑 紅參配方顆粒（批號(hào)：17003221，北京康仁藥業(yè)有限公司）;華法林鈉片（規(guī)格：3mg/片;批號(hào)：1680414;Orion Corporation Orion Pharma）;華法林鈉標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：113062，LGC Labor GmbH.Bgm-Germany）;乙腈 HPLC級(jí)別 （批號(hào)：20170314，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;甲醇 HPLC級(jí)別（批號(hào)：021150601，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?冰乙酸（批號(hào)：K1315019，Aladdin Industrial）;肝素鈉注射液（批號(hào)：151712098A，常州千紅生化制藥股份有限公司）;3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑（批號(hào)：0328A18，上海銘博生物科技有限公司）;全自動(dòng)血液凝固分析裝置清洗液[批號(hào)：A7118，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司];凝血酶試劑[批號(hào)：562801，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司];凝血質(zhì)控血漿水平（批號(hào)：548029A，Dade Ci-Trol）;水為自制純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重（250±20）g（福建省福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)，許可證：SCXK（閩）2012-0001）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 華法林標(biāo)準(zhǔn)液 精密稱取華法林鈉標(biāo)準(zhǔn)品10.07mg置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇超聲溶解后定容，即得1.007mg/mL的華法林貯備液。精密吸取華法林貯備液1mL置于100mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇定容，即得10.07μg/mL的華法林標(biāo)準(zhǔn)溶液。均置于2～8℃冰箱中保存待用。

2.1.2 華法林溶液配制 華法林鈉3片（3mg/片）置于研缽研磨成細(xì)粉，溶于300mL水超聲溶解時(shí)即得濃度為0.030mg/mL的華法林溶液。

2.1.3 紅參水溶液配制 稱取紅參顆粒5.4g，加純化水300mL，超聲溶解，配制成0.018g/mL紅參水溶液（1g紅參顆粒相當(dāng)于5g紅參飲片）。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法 雄性SD大鼠35只，體重（220±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，隨機(jī)分為五組，每組7只大鼠，分別為：A組（空白組）、B組（紅參組）、C組（華法林組）、D組（紅參同服組）、E組（紅參預(yù)服組）。其中A組灌胃蒸餾水;B組灌胃紅參顆粒水溶液（0.18g/kg）;C組灌胃華法林溶液（0.3mg/kg）;D組先給予華法林溶液灌胃（0.3mg/kg），給藥1h后，再灌胃紅參顆粒水溶液（0.18g/kg）;E組先預(yù)服紅參7d，后華法林和紅參給藥方法同D組。上述5組大鼠藥物連續(xù)灌胃給藥14d。

2.2.2 血漿樣品的采集與處理 測(cè)定凝血酶原時(shí)間（Plasma prothrombin time，PT）血漿樣本：A組、B組、C組、D組和E組5組大鼠分別于華法林灌胃前（D0）和給藥后的D1、D4 、D7、D10、D14 采血點(diǎn)，經(jīng)大鼠眼眶采血0.9mL置于含有3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑0.1mL的抗凝管中，血液與抗凝劑的比例為9∶1（V∶V），充分混勻，立即離心力1500g，離心15min，分離血漿，室溫保存，24h內(nèi)待測(cè)。每次采血時(shí)間均為華法林給藥后3h。

測(cè)定華法林血藥濃度血漿樣本：C、D、E組大鼠于華法林灌胃給藥后的D1、D4 、D7、D10、D14采血點(diǎn)，經(jīng)大鼠眼眶采血1mL置于肝素鈉化EP管中，充分混勻，立即離心力1500g，離心15min，分離血漿，保存待測(cè)。每次采血時(shí)間均為華法林給藥后3h。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 凝血酶原時(shí)間（PT）及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）的測(cè)定 將經(jīng)3.2%枸櫞酸鈉抗凝的血漿適量放入測(cè)試通道，采用凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，通過(guò)全自動(dòng)血凝分析儀自動(dòng)檢測(cè)血漿標(biāo)本PT及INR值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.2 華法林血藥濃度的測(cè)定 精密吸取肝素抗凝的血漿100μL，加入乙腈300μL，渦旋1min，10000rpm/min離心15min，取上清液，進(jìn)樣20μL。記錄色譜圖，以外標(biāo)法進(jìn)行峰面積定量。

2.4 色譜條件的建立 色譜柱：AcclaimTM120C18（250mm×4.6mm，5μm）;柱溫：25℃;流動(dòng)相：乙腈-乙酸水（1%）（70∶30）等度洗脫;流速：1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：308nm;進(jìn)樣量：20μL。結(jié)果如圖1所示。

2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以（x±s）表示，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HPLC方法的專屬性 取空白大鼠血漿180μL，加入100.7μg/mL華法林標(biāo)準(zhǔn)液20μL配成的含華法林10.07μg/mL血漿樣品200μL作為陽(yáng)性對(duì)照血漿。分別取空白大鼠血漿、陽(yáng)性對(duì)照血漿、華法林大鼠血漿、紅參大鼠血漿、華法林+紅參大鼠血漿各100μL，按2.3.2項(xiàng)下的預(yù)處理進(jìn)行操作，得色譜圖（如圖2所示）。紅參與血漿內(nèi)源性成分對(duì)華法林出峰無(wú)干擾，且華法林峰形良好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白大鼠血漿5份，配制成200μL華法林終濃度為50.35μg/mL、10.07μg/mL、7.552μg/mL、5.035μg/mL、2.518μg/mL、1.007μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按2.3.2項(xiàng)下的預(yù)處理進(jìn)行操作，每種濃度平行操作5次，記錄色譜圖華法林峰面積。以華法林色譜峰的峰面積均值為縱坐標(biāo)y，標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖3所示，得到回歸直線方程為y=0.1056x+0.0254，相關(guān)系數(shù)R=0.9996。結(jié)果說(shuō)明：華法林血漿濃度在1.007～50.35μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.3 最低檢測(cè)限 配制華法林終濃度為0.1007μg/mL、0.504μg/mL、1.007μg/mL的血漿，按2.3.2項(xiàng)下的預(yù)處理進(jìn)行操作，取上清，進(jìn)樣20μL。以信噪比為3確定出華法林的最低檢出濃度為0.504μg/mL。

3.4 精密度和準(zhǔn)確度考察 配制華法林終濃度為2.518μg/mL、10.07μg/mL、50.35μg/mL的低、中、高濃度的血漿樣品分別于同1d內(nèi)分5次以及連續(xù)5d，每日1次，按2.3.2項(xiàng)下的預(yù)處理操作后，進(jìn)樣20μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度以及提取回收率、方法回收率，結(jié)果見表1、2。由表1可得該方法測(cè)得的血漿中華法林日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于10%，表明該法對(duì)含量的重現(xiàn)性和重復(fù)性均良好。從表2中得到低、中、高3種濃度的華法林血漿樣品提取回收率均值為91.75%、95.29%、85.17%，方法回收率均值分別為97.44%、109.3%、99.77%。參照生物樣品分析時(shí)的回收率一般要求在85%～115%（樣品藥濃度≥ 200μg/L），RSD小于10%的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)符合生物樣品加樣回收率的要求。

3.5 穩(wěn)定性考察配制成終濃度為低（2.518μg/mL）、中（10.07μg/mL）、高（50.35μg/mL）3種華法林血漿樣品，每種濃度平行配制5份。在室溫下放置24h、24h反復(fù)凍融3次后、冷凍（-20℃）半個(gè)月，按2.3.2項(xiàng)下的預(yù)處理操作后，進(jìn)樣20μL，記錄色譜，結(jié)果見表3。從表3可看出，華法林血漿在未經(jīng)預(yù)處理的狀態(tài)下，室溫24h、24h反復(fù)凍融3次以及冷凍（-20℃）半月后的RSD均在10%以內(nèi)，可見華法林血漿樣品的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果變化均在允許范圍內(nèi)，保證了樣品測(cè)定結(jié)果的可靠性。

3.6 紅參對(duì)大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的影響 運(yùn)用全自動(dòng)凝血分析儀分別測(cè)定A、B、C、D、E組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的PT值變化，并根據(jù)PT值計(jì)算INR結(jié)果（見表4和圖4）。從表4可以看出，與A組相比，B組對(duì)PT沒有影響。與C組比較，D組和E組PT值均有不同程度的延長(zhǎng)，其中E組在D7和D10時(shí)PT值延長(zhǎng)具有顯著性差異。同樣，在INR的變化上，與C組比較，E組在D7和D10呈明顯的增高趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但C、D、E組在D14時(shí)，PT和INR未呈現(xiàn)明顯的差別。

3.7 紅參對(duì)大鼠體內(nèi)華法林血藥濃度的影響 紅參對(duì)華法林多次給藥大鼠穩(wěn)態(tài)血藥濃度的影響。從圖5可以看出，在給藥后，E組華法林的血藥濃度較C組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。D組華法林的血藥濃度較C組有升高的趨勢(shì)，但亦未達(dá)到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P>0.05）。

4 討論

筆者首探討并建立了在聯(lián)用紅參和華法林的大鼠血漿中測(cè)定華法林含量的HPLC法，該法操作簡(jiǎn)單，專屬性、精密度、重現(xiàn)性和重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，可作為紅參與華法林藥物相互作用的研究中測(cè)定華法林血藥濃度的可靠方法。

從紅參對(duì)華法林藥效學(xué)影響結(jié)果看出：紅參單藥對(duì)PT值無(wú)明顯影響，表明紅參單藥對(duì)凝血無(wú)明顯影響。與華法林組比較，預(yù)服組大鼠PT和INR值在給藥的第7天和第10天顯著延長(zhǎng)，而同服組PT和INR也有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，紅參同服組和紅參預(yù)服組與華法林組PT、INR值未再顯示明顯的差別。驗(yàn)結(jié)果提示紅參與華法林聯(lián)合用藥后可產(chǎn)生藥效學(xué)的協(xié)同作用，增強(qiáng)華法林的抗凝作用。本研究結(jié)果與既往人參和西洋參抑制華法林的抗凝作用的結(jié)果不同[5-6]，可能是由于紅參經(jīng)過(guò)炮制加工后，其所含有效成分與人參或西洋參不同有關(guān)。

從血藥濃度結(jié)果看，紅參同服組和預(yù)服組華法林血藥濃度有升高的趨勢(shì)但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而其PT和INR值卻有顯著性差異。華法林為S型和R型兩種光學(xué)異構(gòu)體組成的消旋體混合物[7]。S-華法林主要經(jīng)CYP2C9代謝，R-華法林主要經(jīng)CYP1A2和CYP3A4代謝，且S-華法林的藥理作用約為R-華法林作用的3-5倍。由于本研究未對(duì)華法林對(duì)映異構(gòu)體濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推測(cè)，紅參可能對(duì)S-華法林的影響強(qiáng)于R-華法林，導(dǎo)致雖然華法林總體濃度變化不明顯，但仍然可以引起藥效學(xué)有意義的改變。

筆者觀察了紅參對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)血藥濃度及抗凝作用的影響，提示紅參可能增強(qiáng)華法林的抗凝作用。在臨床實(shí)踐中，應(yīng)提醒臨床對(duì)于正在服用紅參的患者，在初始處方華法林時(shí)應(yīng)注意劑量調(diào)整，適當(dāng)減少華法林的劑量，并在用藥的前2周加強(qiáng)監(jiān)測(cè)INR，以減少紅參與華法林兩藥聯(lián)合應(yīng)用可能導(dǎo)致的出血風(fēng)險(xiǎn)。由于筆者未對(duì)華法林對(duì)映異構(gòu)體濃度進(jìn)行檢測(cè)，紅參是否是通過(guò)影響CYP2C9的活性而影響S-華法林濃度進(jìn)而增強(qiáng)華法林抗凝作用值得進(jìn)一步的探索。在今后的研究中，將可進(jìn)一步觀察紅參對(duì)S-華法林血藥濃度以及對(duì)肝藥酶CYP2C9的影響，探討紅參與華法林相互作用的機(jī)制。

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（收稿日期：2019-05-14 編輯：陶希睿）