甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留量及清洗方式研究

馬偉超，李一婧，曹會弟

（天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅天水741001）

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，為確保農(nóng)作物增產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)種植過程中大量使用各種化肥農(nóng)藥和人工合成物[1]。但農(nóng)藥在提高果蔬產(chǎn)量的同時也給蔬菜帶來農(nóng)藥殘留問題[2]，殘留的農(nóng)藥嚴(yán)重污染了水、空氣和土壤，再加上生物食物鏈的富集作用[3]，對人類的身體健康造成極大的威脅，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致人畜出現(xiàn)中毒現(xiàn)象[4]，尤其是像甘藍(lán)這樣的人們?nèi)粘Ｉ攀持斜夭豢缮俚氖卟恕?/p>

甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）的學(xué)名是“結(jié)球甘藍(lán)”，俗稱包菜、蓮花白、卷心菜、圓白菜等，在西方國家被看作保健價值很高的蔬菜[5]，里面含有多種微量元素，特別是邊葉中鈣含量可達(dá)26.5 g/kg，是葉球的3 倍多[6]，此外還有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等。近年亦有研究表明，甘藍(lán)多酚類化合物中的吲哚類化合物對癌細(xì)胞具有一定的抑制作用[7]。甘藍(lán)可以做成各種各樣好吃又營養(yǎng)的美食，也是天水地區(qū)制作漿水的主要原料之一。漿水作為天水的特色小吃，可以作為預(yù)防中暑的飲料，也可以消炎降血壓，夏天常食有利于健康，用其做成的漿水面深受土生土長的天水人和外來游客的喜愛，因而甘藍(lán)在天水地區(qū)被廣泛種植。

吡蟲啉是甘藍(lán)種植過程中常用農(nóng)藥之一，主要防治蚜蟲、葉蟬、飛虱、薊馬等刺吸式口器害蟲[8]，其化學(xué)名為 1-（6-氯-3 吡啶甲基）-N-硝基咪唑-2-亞胺，具有很好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性及高的選擇性和生物活性[9]，吡蟲啉具有神經(jīng)毒性作用，能直接與乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）結(jié)合，引起不斷的刺激傳遞而缺少乙酰膽堿酯酶的消除能力，從而擾亂昆蟲正常的神經(jīng)活動[10]，所以吡蟲啉是一種高效、內(nèi)吸的廣譜性殺蟲劑[11]。除廣泛應(yīng)用于果蔬、花草等害蟲防治外，還可用于家庭寵物衛(wèi)生的防治，或用于運(yùn)動場、高爾夫球場、社區(qū)等草坪害蟲的防控[12]。

隨著使用量的增加，吡蟲啉對生物及人群的毒性影響得到了人們越來越多的關(guān)注。研究表明，吡蟲啉對雄性大鼠經(jīng)口LD50為681 mg/kg，雌性為825 mg/kg，經(jīng)皮的LD50雌雄兩性都大于2 150 mg/kg，中毒的大鼠表現(xiàn)為抑制作用，出現(xiàn)呼吸急促、側(cè)臥等癥狀[13]。還有研究報道吡蟲啉具有改變DNA 鏈完整性、染色體完整性和致突變性等遺傳毒性[14]。閆文等對吡蟲啉毒性研究發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)的吡蟲啉可能有潛在影響學(xué)習(xí)記憶的作用[15]。此外，吡蟲啉對蜜蜂的毒性極高（LD50為 0.030 μg/只）[16]，歐洲食品安全局報道，包括吡蟲啉在內(nèi)的3 種煙堿類農(nóng)藥與蜜蜂數(shù)量大減有最為密切的關(guān)系，歐盟曾于2013年對其進(jìn)行過為期兩年的禁用[17]。此外，土壤對吡蟲啉具有吸附性，而土壤中農(nóng)藥的移動性能是評價農(nóng)藥對地下水污染的重要指標(biāo)，吡蟲啉是具有中等移動性的農(nóng)藥品種，對地下水的污染有一定的影響[18]。可見吡蟲啉對人體和生物環(huán)境都有極大的威脅，檢測其殘留量十分必要。

近年來，隨著檢測技術(shù)的逐漸完善，水果蔬菜中的農(nóng)藥殘留的分析方法有了很大的突破[19]，目前吡蟲啉殘留的檢測方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[20]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[21]、高效色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[22]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）[23]、熒光法[24]、和膠體金免疫層析法（the gold immunochromatographic assay，GICA）[25]等。例如李廣領(lǐng)等運(yùn)用氣相色譜法檢測了卷心菜中吡蟲啉的殘留，結(jié)果顯示吡蟲啉在濃度為0.5 μg/L～100 μg/L 內(nèi)有良好的線性關(guān)系，定量檢測限分別為0.005 3 mg/kg，該方法準(zhǔn)確度與精密度好，實用性強(qiáng)[20]。張雪輝等用高效液相色譜法測定了西紅柿、結(jié)球甘藍(lán)等幾種蔬菜中的吡蟲啉，先用乙腈提取樣品，經(jīng)過凈化等處理，再用帶有紫外檢測器的高效色譜儀進(jìn)行測定，得出吡蟲啉在0.1 mg/L至1.0 mg/L 的添加范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，線性關(guān)系系數(shù)R2為0.992 5，西紅柿的平均回收率為95.4%～106.8%，相對偏差為2.66%～7.99%，最低檢測限為0.01 mg/kg，表明該方法能較準(zhǔn)確、快速地監(jiān)測蔬菜中的吡蟲啉[21]。梁秀美等用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了蜂蜜與蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物，此方法中樣品經(jīng)酸化的乙腈提取兩次，再經(jīng)新型凈化脫脂材料EMR 凈化，檢測結(jié)果顯示，蜂花粉和蜂蜜中吡蟲啉及其代謝物有良好的線性范圍，其相關(guān)系數(shù)在0.999 2～1.000 0 之間，吡蟲啉的檢出限為 0.2 μg/kg，定量檢出限為0.60 μg/kg，能滿足定量分析的基本要求[22]。譚國新等用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定了上海青基質(zhì)中的吡蟲啉殘留，表明吡蟲啉在0.000 5 mg/L～0.5 mg/L 的線性范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)在0.999 5 以上，吡蟲啉的定量限低至3.1×10-6mg/kg，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，滿足國內(nèi)外對農(nóng)藥殘留分析的相關(guān)要求[23]。趙曉陽等用熒光法測定了蘋果中的吡蟲啉，確定了吡蟲啉的最佳激發(fā)波長為234 nm，在蘋果汁中吡蟲啉的主特征波長為373 nm，且熒光強(qiáng)度隨吡蟲啉濃度的增加而增大，從而建立熒光法測定吡蟲啉的方法，具有便捷、快速等優(yōu)點[24]。樓小華等采用以檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金標(biāo)記吡蟲啉單克隆抗體的方法，創(chuàng)建并優(yōu)化了膠體金免疫層析法，用膠體金免疫層析法快速檢測了煙草中吡蟲啉的殘留，其檢出限為5 μg/mL，檢出結(jié)果經(jīng)氣相色譜法驗證，符合率高達(dá)96%，說明膠體金免疫層析法可對煙草中的吡蟲啉進(jìn)行定性檢測，而且整個分析過程耗時短，超不過20 min，此方法具有快速簡便、靈敏度高等特點，適合市場監(jiān)控、現(xiàn)場臨時抽檢等[25]。

綜上所述，在眾多的吡蟲啉的檢測方法中，熒光法和膠體金免疫層析法的檢測結(jié)果都有不確定性，需要進(jìn)一步的驗證，過程繁瑣；雖然幾種液相的檢測方法中檢出限由高到低的排序是：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法＞高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法＞高效液相色譜法，但超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀價格昂貴，許多實驗室都沒有配置；夏曉明等在綜述中也提到有相關(guān)試驗表明，氣相色譜法不適合直接測定吡蟲啉，帶有紫外檢測器的HPLC 法在各方面都優(yōu)于GC，而且吡蟲啉是一個極性強(qiáng)但對熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥[26]，因此本試驗采用高效液相色譜法研究天水市秦州區(qū)部分地區(qū)的甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留情況以及清洗方式對殘留量的影響，為蔬菜購買地和清洗方式的選擇提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）：上海晶純生化科技股份有限公司；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作液：用甲醇（色譜純）稀釋吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 倍至質(zhì)量濃度為1 mg/L；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：默克股份有限公司；無水硫酸鎂（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司，200 ℃灼燒2 h，冷卻后置于干燥器中備用；乙腈（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；超純水：ULUP-II-10T 優(yōu)普超純水器制得，電阻率為18.25 MΩ。

1.1.2 材料

甘藍(lán)：購自堅家河菜市場（A）、瀛池菜市場（B）、蘭天菜市場（C）、物美超市（D）、五洲超市（E）、蘭天超市（F）；容量瓶（500、1 000 mL）：四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；離心管（50 mL）、一次性注射器（1 mL）、0.22 μm有機(jī)濾膜、自封袋等：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 型高效液相色譜儀（DAD 檢測器）：美國 Agilent 公司；ULUP-II-10T 型超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；ME4002E 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H2100R 醫(yī)用離心機(jī)：長沙開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；D500 均質(zhì)機(jī)：北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；A17 型破壁機(jī)：佛山市順德區(qū)格明電器實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

早上9 點左右去6 個銷售地點采樣，連續(xù)采3 d，將3 d 采的樣各取50 g（整個葉球的四分之一或八分之一）按購買地分類存放在冰箱的塑料袋中，3 個菜市場的甘藍(lán)邊葉按照相同的方法存放。

1.3.2 樣品的制備

將分好的樣品放入破壁機(jī)中勻漿，然后分別裝入貼好地方標(biāo)簽的自封袋中，在冰箱中于-4 ℃保存。其中需要清洗的樣品在清洗時浸泡5 min，清洗完等自然晾干后再勻漿，每勻漿完1 個樣品，都要清洗破壁機(jī)，以免樣品之間交叉污染。

1.3.3 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將配置好的濃度為1 mg/L 的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按 0、4、5、10、15、20 μL（即 0、4、5、10、15、20 ng）進(jìn)樣。

檢測條件為色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（美國 Agilent）；檢測波長：270 nm；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈/水=40/60（體積比）；流速：1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4 甘藍(lán)中吡蟲啉殘留檢測

吡蟲啉的測定參考國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1275-2007《蔬菜、水果中吡蟲啉殘留量的測定》[27]：準(zhǔn)確稱取10 g 左右（精確至0.01）樣品于50 mL 具塞離心管中，加入乙腈10 mL，在高速均質(zhì)機(jī)上均質(zhì)2 min，然后加入無水硫酸鎂6 g，在渦旋振蕩器上振蕩搖勻后靜置30 min，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 的離心機(jī)上離心4 min，用移液槍將上清液全部轉(zhuǎn)入另一50 mL 的具塞離心管中，用氮吹儀40 ℃下濃縮至干，然后加入1 mL 的甲醇溶解，超聲20 s 保證它們充分溶解，再經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)膜濾入進(jìn)樣瓶，每份樣品做3 個平行樣，待測，檢測條件同上。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS V20（IBM 公司）進(jìn)行分析，各試驗條件數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（ANOVA）及Tukey Post Hoc 檢驗。圖表制作使用OriginPro 8.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of imidacloprid

以吡蟲啉的含量（0、4、5、10、15、20 ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由圖1 可以看出，吡蟲啉在色譜柱為 C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm、檢測波長為270 nm、柱溫為40 ℃、流動相為乙腈+水（40+60）、流速為1.0 mL/min 的條件下有較好的線性關(guān)系，線性回歸方程方程為y=2.660 4x+0.716 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6。

2.2 不同來源的甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留情況

對不同銷售地點采購的甘藍(lán)中吡蟲啉殘留量進(jìn)行了檢測見圖2。

圖2 不同來源的甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留量Fig.2 Imidacloprid residues in cabbage from different market

由圖2 可知，堅家河菜市場（A）的吡蟲啉含量明顯高于其他地方（p=0.013，α=0.05），吡蟲啉殘留量達(dá)到0.25 mg/kg，但未超過GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定甘藍(lán)中吡蟲啉的最大殘留量為1 mg/kg[28]。高的原因可能是甘藍(lán)在生長的每個階段都在使用吡蟲啉，而且噴藥間期太短，造成了農(nóng)藥在甘藍(lán)中的積累。蘭天超市的甘藍(lán)未檢出，說明之前沒有噴灑農(nóng)藥或早期噴灑的吡蟲啉降解，殘留量太小而未檢出。菜市場的甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留量普遍高于超市的，其可能的原因是菜市場賣家一般都是當(dāng)?shù)氐牟宿r(nóng)，噴藥的時間和方式一般很隨意，次數(shù)也比較頻繁，沒有食品安全意識。而超市在采購蔬菜時通常會對農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測，一定程度上控制了蔬菜種植過程中的農(nóng)藥使用量和噴藥時間。

2.3 甘藍(lán)邊葉與葉球中吡蟲啉殘留量的比較

根據(jù)形態(tài)的變化，甘藍(lán)的生長過程一般分為幼苗期，定植期，始球前期，結(jié)球期和收獲期[29]，可見邊葉比葉球形成的早，所以經(jīng)歷的噴藥次數(shù)也多，而且兩者結(jié)構(gòu)形態(tài)不同，使人們產(chǎn)生了邊葉中農(nóng)藥殘留量多于葉球的誤解。因此，對3 個菜市場的甘藍(lán)邊葉與甘藍(lán)葉球中吡蟲啉殘留量進(jìn)行了測定，堅家河菜市場（A）采購的甘藍(lán)葉球與另外兩個市場銷售的甘藍(lán)葉球存在顯著差異（p＜0.01，α=0.05），堅家河菜市場（A）銷售的甘藍(lán)邊葉與蘭天菜市場（C）銷售的甘藍(lán)邊葉有顯著差異（p=0.029，α=0.05），結(jié)果見圖3。

有研究表明吡蟲啉在水中即使無催化劑也能在紫外光照射下會被降解成簡單的無機(jī)物，并且光照強(qiáng)度越大，降解速度越快[30]，作為在最外層的邊葉，它們受到的陽光照射和雨水比葉球多，導(dǎo)致部分農(nóng)藥降解；甘藍(lán)邊葉吸收的養(yǎng)分會向葉球運(yùn)輸[6]，所以殘留在土壤中的吡蟲啉經(jīng)根部吸收，再由邊葉轉(zhuǎn)運(yùn)給葉球，再加上吡蟲啉是一種內(nèi)吸性農(nóng)藥，蔬菜的不同部位對吡蟲啉的吸收不同[31]，這幾點導(dǎo)致葉球中吡蟲啉的含量大于邊葉。

圖3 3 個菜市場的甘藍(lán)邊葉和葉球中的殘留量Fig.3 Imidacloprid residues in side leaves and leafballs of cabbage from three vegetable markets

2.4 同一來源的甘藍(lán)清洗效果的比較

由于購自堅家河菜市場（A）的甘藍(lán)檢測出少量吡蟲啉的殘留（如2.2 和2.3 所示），為研究不同清洗方法對吡蟲啉的去除效果，選用采購于A 市場的甘藍(lán)為研究材料，分別將邊葉和葉球使用清水、淡堿水（1.5%）和鹽水（0.9%）浸泡5 min，而后清洗、自然晾干后再勻漿、檢測。以未清洗的甘藍(lán)為對照，得出不同清洗方法的吡蟲啉去除效果如圖4 所示。

圖4 不同清洗方式處理后甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留量及去除率Fig.4 Residue and removal rate of imidacloprid in cabbage treated by different cleaning methods

雖然3 種清洗方式都能減少農(nóng)藥的殘留量，但堿水和鹽水的去除效果比清水好，清水對邊葉的去除率為18.1%，葉球的去除率為80.09%，堿水和鹽水對邊葉和葉球的去除率都為100%，這與吡蟲啉的性質(zhì)有關(guān)，有研究表明，吡蟲啉在中性或酸性條件下水解不明顯，在弱堿條件下能緩慢水解，并且隨著堿性增強(qiáng)，水解的速度也會明顯加快[32]。清水對邊葉和葉球的去除率也有明顯的差異，主要由于吡蟲啉在水中的溶解度為 0.51 g/L（20 ℃），在水中有一定的溶解度[33]，甘藍(lán)葉球的水分含量比邊葉大，因而葉球比較容易除去。所以洗菜的時候可以用少量的鹽和堿等有效的去除劑來減少果蔬中的農(nóng)殘，洗邊葉的時候可以多洗幾次。

農(nóng)藥是一把雙刃劍，適當(dāng)?shù)厥褂脮岣咿r(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，大量使用會降低農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量[34]。農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺，過量使用會導(dǎo)致環(huán)境污染和人體健康的損害等一系列問題，對于這種現(xiàn)象，政府相關(guān)部門應(yīng)一方面加強(qiáng)宣傳教育，提高果樹種植戶對農(nóng)藥危害的認(rèn)識，使他們能合理使用農(nóng)藥，學(xué)習(xí)農(nóng)藥正確的使用方法，掌握好農(nóng)藥的安全間隔期。另一方面加大監(jiān)管力度，制定合理的管理規(guī)則，保證食品質(zhì)量安全[35]。作為消費者，也應(yīng)該有食品安全意識，在買菜時去相對正規(guī)的地方去買，在食用時應(yīng)選擇有效的清洗方式。

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜法檢測了天水市區(qū)不同銷售地點的甘藍(lán)中吡蟲啉的殘留量，并對比了甘藍(lán)的邊葉和葉球上吡蟲啉殘留量，以及不同清洗方式對殘留的吡蟲啉去除效果，主要得出3 個結(jié)論（1）天水市秦州區(qū)不同銷售地點采購的甘藍(lán)中的吡蟲啉殘留量均未超出GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》要求；（2）甘藍(lán)葉球的殘留量高于邊葉；（3）使用堿水和鹽水清洗可有效去除甘藍(lán)中殘留的吡蟲啉。