野生椒蒿總黃酮的純化工藝及抗氧化活性研究

吳昊，唐濤浪，劉偉，閆秀玲

（伊犁師范大學化學與環(huán)境科學學院新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆伊寧835000）

黃酮廣泛的存在于植物中，目前的研究表明，黃酮類化合物具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛[1]、抗腫瘤[2]、抑菌[3]、治療心腦血管疾病和免疫調(diào)節(jié)作用[4]，最近的研究還表明，黃酮類化合物對糖尿病腎病有一定的預防作用[5]。

椒蒿（Artemisia dracunculus L.），被子植物門，具有類似花椒的氣味，多年生草本植物，分布在我國北部及西北部，椒蒿富含胡蘿卜素、維生素C、生物堿、鈣、鋅等微量元素。椒蒿具有增強免疫力，治療風寒感冒，同時具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[6-8]，也有記載椒蒿曾被用于治療水腫和抗壞血病。

近幾十年發(fā)展起來的大孔吸附樹脂是一種高分子聚合物。目前廣泛用于中藥行業(yè)和天然產(chǎn)物中的各類有效成分的純化，具有成本低、選擇性好、吸附速度快、洗脫速度快、吸附容量大和使用壽命長等特點[9-10]。

根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀，已有研究人員運用GC-MS對椒蒿當中揮發(fā)油的化學成分及其生物活性進行了分析[11]，另外也有研究人員對黃酮提取工藝進行了研究[12]，但目前關(guān)于椒蒿的研究還主要是側(cè)重于揮發(fā)油成分分析及生物活性研究，以及對椒蒿中總黃酮的粗提取，并未見關(guān)于椒蒿總黃酮提取之后的純化方法及抗氧化活性的報道，所以本文應用對天然產(chǎn)物具有良好富集效果的大孔吸附樹脂對椒蒿中的總黃酮進行純化，分析對純化過程中的相關(guān)影響因素，并采用ABTS+對純化后的總黃酮進行抗氧化活性分析，以期為野生椒蒿的綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

椒蒿樣品均是5 月采于新疆伊犁察布查爾縣烏孫山，采摘部位是尖端部分（生長期），將新鮮采摘的椒蒿進行陰干粉碎；標準品蘆?。兌取?5%）：上海源葉生物科技有限公司；7 種大孔吸附樹脂為：HPD-100、HPD-600、HPD-826、ADS-17、X-5、AB-8 和 D101：東鴻化工有限公司；ABTS+：上海伊卡生物試劑；維生素C：天津北辰方正試劑廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：天津福晨化學試劑廠；無水乙醇（分析純）：天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)公司。

1.2 試劑

UV-250 紫外分光光度計：日本島津公司；BSA124S電子天平：德國賽多利斯公司；HH-S1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；Precision MLG3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫集團；BAO-150AG 型真空干燥箱：施都凱儀器設備上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

取陰干的椒蒿粉末250 g，放到索氏提取器中，加入10 倍～15 倍的石油醚，反復抽提10 h，揮干石油醚后，將椒蒿粉末置于干燥箱內(nèi)50 ℃恒溫干燥6 h。

1.3.2 野生椒蒿總黃酮粗提物的制備

將處理過的椒蒿粉末按照料液比1 ∶30（g/mL）、溫度85 ℃、體積分數(shù)為40%的乙醇溶液回流提取1 h，過濾，將濾液減壓濃縮至稠膏，加蒸餾水定容，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標準曲線的繪制

以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[13]測定野生椒蒿總黃酮含量。蘆丁在烘箱中以105 ℃干燥至恒重，在干燥器當中冷卻后，稱取10 mg 用40%的乙醇溶解，定容到10 mL 的容量瓶中，再精確吸取2.5 mL 至25 mL 的容量瓶中。用40%乙醇稀釋定容，即得100 μg/mL 的蘆丁標準溶液。

吸取蘆丁標準溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入0.5 mL 的5%NaNO2溶液，揺勻后放置6 min，再加入0.5 mL 的10%Al（NO3）3溶液，揺勻后靜置6 min，加入4%的NaOH溶液4.0 mL，體積分數(shù)為40%的乙醇定容，揺勻后靜置15 min。在510 nm 處測量吸光度。以x（蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL）為橫坐標，以y（吸光度）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

回歸方程為：y=14.788x-0.021 2（相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 7）

1.3.4 總黃酮含量測定

吸取一定量的粗提液按照1.3.3 方法顯色，根據(jù)回歸方程測定樣品中黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.5 樹脂預處理

稱取 D101、AB-8、HPD-100、HPD-600、HPD-826、X-5、ADS-17，7 種樹脂各 3 g，按照參考文獻[14]的方法進行預處理。

1.3.6 測定樹脂吸附量、吸附率及解吸率

選取潔凈的具有具塞磨口的錐形瓶，將已處理好的各型號樹脂（3 g）倒入錐形瓶，加入30 mL、1.18 mg/mL的粗提液，在25 ℃恒溫振蕩器振蕩12 h，振蕩頻率120 r/min。吸附平衡后，過濾，將過濾后的不同型號樹脂分別置于錐形瓶當中，加入30 mL 無水乙醇，解吸12 h。將一定量的吸附后溶液和解吸后的溶液，加入到10 mL 容量瓶內(nèi)按照1.3.3 的方法顯色，于510 nm 波長下測量吸光度，按照下面的公式計算不同型號樹脂的吸附量、吸附率和解析率[15]。

吸附量=[（C0×V0）-（C1×V1）]/m0

吸附率/%=[（C0×V0-C1×V1）/C0×V0]×100

解析率/%={C2×V2/[（C0×V0-C1×V1）]}×100

浸膏中總黃酮含量/%=（m2/m1）×100

式中：C0為椒蒿粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為粗提液的體積，mL；C1為大孔吸附樹脂吸附后的溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為大孔吸附樹脂吸附后的溶液的體積，mL；C2為解吸液中總黃酮濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL；m1為干燥解吸液后的固體質(zhì)量，mg；m2為解吸液當中總黃酮質(zhì)量，mg。

1.3.7 樹脂的吸附試驗

1.3.7.1 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的靜態(tài)吸附試驗

選取潔凈的具有具塞磨口錐形瓶，將3 g AB-8 型大孔吸附樹脂小心裝入到錐形瓶中，倒入30 mL 1.27 mg/mL的野生椒蒿總黃酮粗提液，然后將其放入恒溫振蕩器中，選擇溫度為 25 ℃，轉(zhuǎn)速 120 r/min，振搖6 h，每隔0.5 h 各取1 mL 測定黃酮質(zhì)量濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.3.7.2 吸附液pH 值對大孔吸附樹脂吸附率和吸附量的影響

選取潔凈的具有具塞磨口錐形瓶，將3 g AB-8 型大孔吸附樹脂小心裝入到錐形瓶中，設置pH 值為4、5、6、7、8 各 30 mL 的粗提液然后將其放入恒溫振蕩器中，選擇溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，振搖12 h，測定吸附后溶液中的野生椒蒿總黃酮質(zhì)量濃度并計算吸附率。

1.3.8 AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的動態(tài)吸附試驗

1.3.8.1 動態(tài)累計泄露曲線

采用濕法，將處理好的AB-8 型樹脂緩慢裝柱，吸附柱的大小為：1.5 cm × 30 cm，25 ℃下將 1 mg/mL 的粗提液按1 BV/h 的流速上樣，按照柱體積（BV）收集流出液，測定每一份柱體積（50 mL）流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度，泄漏點為流出液中總黃酮濃度為純化前粗提液總黃酮濃度的1/10，繪出泄露曲線。

1.3.8.2 質(zhì)量濃度對AB-8 大孔吸附樹脂的吸附量影響

把野生椒蒿黃酮的粗提液用蒸餾水稀釋成黃酮質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL 的待上樣液各200 mL，使粗提液的pH 值為4，以2 BV/h 的流速加入含有50 mL AB-8 大孔吸附樹脂的柱子吸附，測定其純化后流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度并計算此時的吸附率。

1.3.8.3 流速對AB-8 大孔吸附樹脂的吸附量影響

取濃度1 mg/mL 的野生椒蒿總黃酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附樹脂的吸附柱中，分別調(diào)節(jié)流速為 1、2、3、4、5 BV/h，加入裝有 50 mL AB-8大孔樹脂的吸附柱中進行吸附，測定純化后流出液當中總黃酮的質(zhì)量濃度，并計算吸附率。

1.3.8.4 洗脫劑用量對AB-8 大孔樹脂解吸椒蒿總黃酮的效果影響

將濃度1 mg/mL 的野生椒蒿總黃酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附樹脂的吸附柱中，調(diào)節(jié)流速2 BV/h 進行吸附，吸附飽和，使用60%乙醇溶液進行洗脫，調(diào)節(jié)洗脫劑流速2 BV/h，分別收集每一柱體積（BV）的洗脫液，并測定其中的黃酮含量。

1.3.8.5 不同濃度乙醇溶液對AB-8 吸附飽和樹脂的洗脫分析

將濃度1 mg/mL 的野生椒蒿總黃酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附樹脂的吸附柱中，調(diào)節(jié)流速為2 BV/h，進行吸附，吸附飽和后，分別用體積分數(shù)20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液200 mL對吸附飽和的樹脂進行洗脫，測定不同體積分數(shù)的洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.9 清除ABTS+試驗

參考荊常亮[14]的方法，取7 mmol/L 25 mL ABTS+溶液與25 mL 2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合、避光靜置20 h，得ABTS+反應液，將1 mL ABTS+反應液加入到100 mL 無水乙醇中，之后用無水乙醇將該溶液逐級稀釋到吸光值為（0.7±0.02）。取各濃度（0.2、0.4、0.6、1.0、1.8 mg/mL）的VC和純化后的野生椒蒿總黃酮提取液0.1 mL 與ABTS+反應液混合，避光反應30 min 后，在734 nm 波長下測定吸光度值，根據(jù)公式測定ABTS+的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂類型的篩選

為篩選出最適合的純化野生椒蒿的大孔吸附樹脂，本試驗比較了7 種不同類型的大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮粗提液的吸附特性，結(jié)果見表1。

2.2 靜態(tài)吸附動力學曲線

為得到吸附平衡時間和平衡時的最大吸附量，需繪制出靜態(tài)吸附曲線，AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的靜態(tài)吸附曲線見圖1。

如圖1 所示，在吸附的 0.5 h～2.5 h 內(nèi)，AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的吸附量隨著時間的增加而快速上升，在2.5 h 以后，樹脂對總黃酮的吸附量接近平衡。AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的吸附率為80.2%。分析可知，AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮具有較強的吸附性能，在吸附2.5 h 后達到飽和。

表1 7 種大孔吸附樹脂的性質(zhì)及靜態(tài)吸附和解析性能Table 1 Properties and static adsorption and desorption ability of seven macroporous resins

圖1 AB-8 大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of total flavonoids of Artemsia dracunculus L.on AB-8 macroporous resin

2.3 吸附液pH值對吸附量的影響

在不同的pH 值下黃酮對樹脂的親和力有所不同，不同pH 值下野生椒蒿總黃酮吸附率和吸附量見圖2。

圖2 不同pH 值下野生椒蒿總黃酮吸附率和吸附量Fig.2 Adsorption rate and adsorption amount of total flavonoids in Artemsia dracunculus L.at different pH values

如圖2 所示，溶液的pH 值對樣品的總黃酮吸附率和吸附量有產(chǎn)生了比較大的影響。pH 值從8 下降到7 時吸附率有微小的提升，當酸度從pH7 逐漸降到pH4 時，吸附率發(fā)生大幅度提升，至pH4 時達到最高。故而選取pH4 為最佳上樣pH 值。出現(xiàn)這個現(xiàn)象，推測是因為黃酮中的多酚和糖苷鍵表現(xiàn)出的弱酸性所致[16]。在pH4 的酸性環(huán)境中，樹脂以氫鍵方式對其進行吸附，進而結(jié)合的較為牢固，而在堿環(huán)境中，其上的酚羥基上以酸根離子形式存在，與樹脂結(jié)合力不如氫鍵強，從而降低了吸附率，因此AB-8 大孔吸附樹脂在pH4 的弱酸性條件下對椒蒿總黃酮的吸附效果最好。

2.4 泄露曲線考察

為確定出最佳的上樣體積，需繪制泄露曲線，野生椒蒿總黃酮在AB-8 大孔吸附樹脂上的泄露情況見圖3。

圖3 野生椒蒿總黃酮在AB-8 大孔吸附樹脂上的泄露曲線Fig.3 Leakage curve of total flavonoids from Artemsia dracunculus L.on AB-8 macroporous resin

當流出液中目標成分的濃度為上樣液中目標成分濃度的1/10 時，認為是泄漏點，由圖3 可知，隨著流出液體積的增加流出液中黃酮的質(zhì)量濃度也隨之迅速增加，將其與上樣液相比較，發(fā)現(xiàn)流出液在5 BV 時，發(fā)生泄漏，因此確定上樣體積為1 BV～5 BV。

2.5 質(zhì)量濃度對吸附效果的影響

為了發(fā)揮出大孔吸附樹脂的全部吸附性能，提高吸附效率，需探究質(zhì)量濃度對吸附效果的影響，質(zhì)量濃度對AB-8 大孔吸附樹脂的吸附量及吸附率的影響見圖4。

圖4 質(zhì)量濃度對AB-8 大孔吸附樹脂的吸附量及吸附率的影響Fig.4 Effect of mass concentration on adsorption capacity and adsorption rate of AB-8 macroporous resin

如圖4 所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，吸附率和吸附量逐漸上升，在1 mg/mL 后雖然吸附量依舊較大（樹脂有可能已經(jīng)飽和），但是吸附率出現(xiàn)了較明顯的下降，故最終確定最佳上樣濃度為1 mg/mL。

2.6 流速對吸附效果的影響

上樣時的流速會顯著影響吸附過程中的動力學過程，為了尋找流速與吸附效果的平衡點，需要探究流速對吸附量和吸附率的影響，不同流速下對吸附效果的影響見圖5。

圖5 不同流速下的吸附效果Fig.5 Adsorption effect of different eluants at different flow rates

如圖5 所示，當流速為2 BV/h 吸附量最大，隨著流速逐漸增大，吸附率也逐漸下降，原因可能是因為當流速過大時，傳質(zhì)效率降低，使得野生椒蒿總黃酮成分還沒有被及時吸附就已經(jīng)隨洗脫液流出吸附柱。

2.7 洗脫劑用量的確定

為了使用盡可能少的溶劑，使黃酮充分洗脫下來，需要探究洗脫劑的用量對洗脫效果的影響，不同洗脫劑用量對野生椒蒿總黃酮洗脫的影響見圖6。

從圖6 可以看出，當洗脫劑體積增加時，洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度隨之減小，當洗脫劑體積用量達到4 BV積時，洗脫液中總黃酮濃度已經(jīng)小于0.1 mg/mL，表明此時樹脂上的黃酮類化合物已被充分洗脫，故確定洗脫劑用量為4 BV。

圖6 不同洗脫劑用量對野生椒蒿總黃酮洗脫的影響Fig.6 Effect of different amount of eluting agent on total flavonoids of Artemsia dracunculus L.

2.8 不同體積分數(shù)乙醇溶液對洗脫的影響

洗脫劑的濃度也會影響洗脫效果，洗脫劑的濃度過大或過小都會導致目標成分與樹脂的結(jié)合不能完全破壞。不同乙醇體積分數(shù)下的洗脫效果見圖7。

圖7 不同乙醇體積分數(shù)下的洗脫效果Fig.7 Elution effect of different ethanol concentration

如圖7 所示，在乙醇體積分數(shù)20%～60%的范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，解吸率隨之增大，在乙醇體積分數(shù)為60%時，解吸率最大，為95.30%，表明此時大部分黃酮類化合物均被洗脫，此后隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，洗脫率隨之減小，故確定最佳洗脫劑的乙醇體積分數(shù)為60%。

2.9 ABTS+清除活性

野生椒蒿總黃酮對ABTS+自由基的清除能力見圖8。

圖8 野生椒蒿總黃酮對ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Antioxidant capacity of Total flavonoids from Artemsia dracunculus L.to ABTS+free radical

由圖8 可以看出，隨著VC溶液和純化后野生椒蒿總黃酮溶液質(zhì)量濃度的增加，對ABTS+的清除率逐漸增大，其抗氧化活性逐漸上升，其抗氧化活性和濃度呈一定的依賴性，當野生椒蒿總黃酮提取液質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL 增加到1.6 mg/mL 時，對ABTS+的清除率從7.7%增大到86.4%，當VC質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到1 mg/mL 時，對ABTS+的清除率從25.3%增大到98.6%，當濃度高于1 mg/mL 時，其清除ABTS+的活性沒有顯著增加，在此次試驗條件下，由SPSS 計算可得VC的IC50值為0.411 mg/mL ，野生椒蒿總黃酮的IC50值為1.068 mg/mL，野生椒蒿總黃酮對ABTS+的清除活性小于VC。

3 結(jié)論

本試驗以吸附量、吸附率和解吸率為指標，探究了運用大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的工藝條件，比較了 HPD-100、HPD-600、HPD-826、ADS-17、AB-8、X-5 和D101，7 種不同類型的大孔吸附樹脂對野生椒蒿總黃酮的分離純化效果，結(jié)果表明，比較適合純化野生椒蒿總黃酮的樹脂類型為AB-8 型大孔吸附樹脂，其對野生椒蒿總黃酮的平均吸附量為9.12 mg/g、平均吸附率為77.29%、平均解吸率為74.56%。通過靜態(tài)-動態(tài)吸附試驗，明確了AB-8 型大孔吸附樹脂純化野生椒蒿總黃酮的工藝條件：上樣液濃度為1 mg/mL、上樣流速為2 BV/h、上樣量為5BV、洗脫劑為體積分數(shù)60%的乙醇溶液，洗脫劑用量為4 BV，在上述條件下，野生椒蒿總黃酮提取液經(jīng)AB-8 型大孔吸附樹脂純化后，干浸膏中總黃酮含量13.62%上升到52.4%。

體外抗氧化試驗表明，野生椒蒿總黃酮對ABTS+具有一定的清除活性，且清除活性隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，野生椒蒿總黃酮對ABTS+的IC50值為1.068 mg/mL。以上所有試驗結(jié)果為野生椒蒿這種食藥兼具的野菜在藥品、食品行業(yè)的綜合利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。