恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)生理生化的影響

高鴻偉，胡靜，楊蕊，周勝杰，于剛，馬振華,通信作者

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞572018；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；4.三亞熱帶水產(chǎn)研究所，海南 三亞 572018）

眼斑雙鋸魚(yú)（Amphiprion ocellaris）又稱(chēng)公子小丑，外表酷似京劇中的丑角而得名，隸屬于雀鯛科、雙鋸魚(yú)屬，是熱帶海水觀賞魚(yú)中的一種，因其健壯易養(yǎng)、活潑可愛(ài)而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，甚至供不應(yīng)求，尤其是隨著電影《海底總動(dòng)員》播出，眼斑雙鋸魚(yú)已成為炙手可熱的海水觀賞魚(yú)種。有關(guān)眼斑雙鋸魚(yú)的研究可追溯到上世紀(jì)50年代，為提高養(yǎng)殖效率以滿足市場(chǎng)需求，同時(shí)降低對(duì)野生捕撈的依賴兼顧環(huán)保，多年來(lái)，眾多學(xué)者對(duì)其展開(kāi)了大量研究，包括發(fā)育學(xué)[1]、營(yíng)養(yǎng)學(xué)[2]及病害學(xué)等方面，如Pirarat等[3]及Siva等[4]分別研究了眼斑雙鋸魚(yú)和?？p鋸魚(yú)的淋巴囊腫病的癥狀和組織生物學(xué)，但未見(jiàn)對(duì)其健康用藥的相關(guān)研究。本研究以眼斑雙鋸魚(yú)為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行抗生素恩諾沙星濃度梯度浸泡試驗(yàn)，并對(duì)其相關(guān)生理生化參數(shù)如酶活性及氧化產(chǎn)物含量進(jìn)行測(cè)定分析，為今后更好地利用抗菌藥物提供一定理論依據(jù)。

恩諾沙星（Enrofloxacin）屬于氟喹諾酮類(lèi)藥物（Ftuoroquinolones），又名乙基環(huán)丙沙星。其作用機(jī)理是與DNA回旋酶亞基A結(jié)合，從而抑制了酶的切割與連接功能，阻止了細(xì)菌DNA的復(fù)制，而呈現(xiàn)抗菌作用[5-7]。恩諾沙星被國(guó)家指定為動(dòng)物專(zhuān)用藥，因其具有廣譜抗菌性及低殘留等優(yōu)勢(shì)而廣泛運(yùn)用于動(dòng)物疾病預(yù)防和治療[8-10]，由于其藥效顯著，在水產(chǎn)養(yǎng)殖如魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖方面也漸漸得到廣泛應(yīng)用[11-12]，所以在水產(chǎn)養(yǎng)殖上對(duì)于恩諾沙星用藥量就需要相關(guān)試驗(yàn)探索。因而本試驗(yàn)設(shè)置了0、5（說(shuō)明書(shū)指定安全治療濃度）和10 mg/L 3種恩諾沙星劑量對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)進(jìn)行浸泡處理，探索其健康個(gè)體在恩諾沙星脅迫下生理生化的變化。應(yīng)用分光光度法對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)不同組織消化酶、免疫酶活性及氧化產(chǎn)物含量進(jìn)行測(cè)定分析，分析安全治療濃度及高濃度處理下個(gè)體生理生化的差異，為眼斑雙鋸魚(yú)的健康治療用藥量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以眼斑雙鋸魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，魚(yú)苗由南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心陵水基地人工孵化而來(lái)，試驗(yàn)于該基地原地進(jìn)行。試驗(yàn)前，苗種暫養(yǎng)于水族箱，充氣泵充氧，保證溶氧量≥6.5 mg /L，循環(huán)水連續(xù)供應(yīng)換水，鹽度32±2，水溫（28±1）℃，pH 8.0～8.2，亞硝酸鹽含量小于0.03 mg/L，氨氮含量小于 0.01 mg/L。每天投喂兩次人工顆粒飼料，試驗(yàn)前24 h停止喂食。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱(chēng)取恩諾沙星晶體，溶解于砂濾海水體積為20 L的儲(chǔ)物箱中，配置濃度分別為0、5和10 mg/L的海水溶液，并根據(jù)Fang[13]之前報(bào)道的HPLC方法確定水體中恩諾沙星的濃度。其中0 mg/L處理組為對(duì)照組，說(shuō)明書(shū)所示安全治療濃度5 mg/L為中濃度處理組，10 mg/L為高濃度處理組，共計(jì)3組，每組3個(gè)平行。將90尾健康眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)個(gè)體（1.59±0.33）g隨機(jī)放入以上9個(gè)試驗(yàn)容器中，每個(gè)容器10尾個(gè)體。試驗(yàn)容器連續(xù)充氧，各水質(zhì)參數(shù)與暫養(yǎng)時(shí)相同。以說(shuō)明書(shū)指定最長(zhǎng)治療時(shí)間24 h為試驗(yàn)時(shí)間，期間停止喂食。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)試驗(yàn)容器中隨機(jī)取3尾試驗(yàn)個(gè)體，取樣時(shí)用6 mg/L丁香酚進(jìn)行麻醉，用解剖刀剪取試驗(yàn)個(gè)體的胃、腸及肝組織，其中胃、腸組織用于消化酶活性測(cè)定，肝臟組織用于免疫酶活性及氧化產(chǎn)物含量測(cè)定。所取組織用生理鹽水沖洗干凈并置于液氮罐中進(jìn)行冷激，后保存于-80 ℃冰箱中備測(cè)。

1.3 樣品處理

各試驗(yàn)組所取樣品稱(chēng)重（單位:mg）后，于0.2 mol/L 生理鹽水中，按試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)指定比例分別進(jìn)行研磨，研磨液2 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱中備測(cè)。蛋白、氧化產(chǎn)物含量及各酶活性測(cè)定分別采用相關(guān)試劑盒進(jìn)行（南京建成生物工程研究所）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析（ANOVA），處理間若有顯著差異，再用Duncan 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)免疫酶活性的影響

恩諾沙星對(duì)個(gè)體肝臟免疫酶活性的影響見(jiàn)圖1A～圖1G。試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)GSH、AKP、LZM、GST活性影響顯著（P＜0.05），恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú) SOD、CAT、POD活性影響不顯著（P＞0.05）。不同處理組間，GSH活性隨處理濃度升高呈先降低后升高現(xiàn)象；AKP活性隨處理濃度升高先升高后降低，但中、高濃度組不顯著（P＞0.05）；LZM、GST活性隨處理濃度升高呈上升趨勢(shì)，但LZM活性在5 mg/L分別與0、10 mg/L差異不顯著（P＞0.05），GST活性在0、5 mg/L差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)免疫酶活性的影響

2.2 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性的影響

恩諾沙星對(duì)個(gè)體腸道消化酶活性的影響見(jiàn)圖2A～圖2D。試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶活性影響顯著（P＜0.05）。不同處理組間，個(gè)體胰蛋白酶、脂肪酶活性隨處理濃度升高呈先升高后降低現(xiàn)象，脂肪酶中、高濃度組差異不顯著（P＞0.05），而胃蛋白酶隨處理濃度的升高而降低。恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)淀粉酶活性影響不顯著（P＞0.05）。不同處理組間，個(gè)體淀粉酶活性均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。個(gè)體淀粉酶活性大小隨處理濃度的增加呈遞減趨勢(shì)。

圖2 恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性的影響

2.3 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)氧化產(chǎn)物含量的影響

恩諾沙星對(duì)個(gè)體肝臟LPO、MDA含量的影響見(jiàn)圖3A、圖3B。試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)LPO、MDA含量影響顯著（P＜0.05）。但不同處理組間，個(gè)體淀粉酶活性均存在顯著差異（P＜0.05），且個(gè)體LPO含量隨處理濃度的增加而呈遞增趨勢(shì)，MDA含量隨處理濃度增加呈遞增趨勢(shì)，且高濃度處理組個(gè)體MDA含量顯著高于其他組（P＜0.05），中濃度處理組與對(duì)照組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)氧化產(chǎn)物含量的影響

3 討論

在試驗(yàn)過(guò)程中，恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)3個(gè)處理組均無(wú)個(gè)體死亡現(xiàn)象，而機(jī)體免疫酶、消化酶及氧化產(chǎn)物含量在不同濃度恩諾沙星處理下存在差異，即不同參數(shù)受恩諾沙星處理影響程度不同。

3.1 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)免疫酶活性影響

肝臟是水生動(dòng)物如魚(yú)類(lèi)的重要免疫器官，大量研究表明，眾多免疫反應(yīng)主要發(fā)生在機(jī)體肝臟內(nèi)[14]。免疫酶是動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分[15]，主要包括抗氧化酶類(lèi)和水解酶類(lèi)，前者包括具抗氧化功能酶 GSH、SOD、CAT、POD等，能抑制和清除氧自由基，以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷；后者包括具排毒功能的酶類(lèi)，如AKP、LZM和GST等[16]，能清除異物從而起到保護(hù)機(jī)體的作用[17]。各類(lèi)酶功能不同，但又相互作用，共同完成一系列免疫反應(yīng)，在不同環(huán)境脅迫下，不同酶活性變化不同[18]。

本試驗(yàn)研究中，眼斑雙鋸魚(yú)GSH、GST活性對(duì)恩諾沙星較為敏感。GST是藥物代謝Ⅱ相反應(yīng)中一類(lèi)重要的藥物代謝轉(zhuǎn)移酶，可催化相當(dāng)多的外來(lái)物，包括大多數(shù)藥物的代謝[19-20]，在10 mg/L濃度時(shí)，酶活性水平急劇增強(qiáng)，這可能是與 10 mg/L下GSH酶活水平的增強(qiáng)有關(guān)。陳琛等[21]研究表明，GSH作為生成GST的反應(yīng)底物，二者可能同時(shí)對(duì)恩諾沙星起了應(yīng)答作用，共同保護(hù)了肝組織。GSH活性隨著濃度增加出現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象，推測(cè)在恩諾沙星藥物應(yīng)激下，GSH結(jié)合GST功能起到了主要免疫功能，即在應(yīng)對(duì)恩諾沙星應(yīng)激的免疫反應(yīng)中，排異反應(yīng)起主導(dǎo)作用，抗氧化反應(yīng)起次要作用，AKP及LZM的變化趨勢(shì)亦證明了該推斷。AKP是生物體內(nèi)重要的解毒、排異體系[22]，個(gè)體肝臟AKP酶活性于安全治療濃度處理下，即出現(xiàn)顯著升高現(xiàn)象，證實(shí)5 mg/L時(shí)機(jī)體即受到脅迫且AKP活性升高以啟動(dòng)解毒、排異功能，而10 mg/L處理下，其活性的降低暗示該濃度可能超出了肝組織的解毒能力，抑制了AKP活性，該現(xiàn)象與蔡深文等[23]研究乳酸諾氟沙星對(duì)草魚(yú)肝臟AKP影響結(jié)果一致。LZM作為水生生物生理防御水平的重要指標(biāo)，是一種重要的非特異性免疫因子[24]，5 mg/L處理下，個(gè)體LZM活性雖然與對(duì)照組差異不顯著，僅在10 mg/L時(shí)差異顯著，但其活性與處理濃度呈正相關(guān)性，表明個(gè)體在藥物刺激作用下，LZM的免疫即排異機(jī)能已逐步啟動(dòng)以對(duì)抗異物侵?jǐn)_、保護(hù)機(jī)體免受損傷。張麗敏等[25]研究表明，高濃度恩諾沙星處理對(duì)紅笛鯛LZM活性影響較小，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果存在差異，因此高濃度對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)LZM活性的影響規(guī)律還需進(jìn)一步探索。不同酶對(duì)恩諾沙星所表現(xiàn)的應(yīng)激有很大差異，顯示了不同酶的不同功能及先后反應(yīng)機(jī)理，亦反映了不同酶間的免疫反應(yīng)關(guān)聯(lián)，其內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中，不同酶應(yīng)對(duì)恩諾沙星不同濃度處理的變化規(guī)律，顯示了即使在安全濃度處理下，機(jī)體酶活性即與對(duì)照組存在差異，甚至部分酶活性差異較顯著，因此在給眼斑雙鋸魚(yú)用藥時(shí)應(yīng)注意用量控制。

3.2 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)消化酶活性影響

胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶均是消化系統(tǒng)中重要的消化酶。消化酶活性是反映魚(yú)類(lèi)消化生理機(jī)能的重要指標(biāo)[26]。本試驗(yàn)中，除淀粉酶所受影響較?。ǜ鳚舛忍幚黹g酶活性差異均不顯著）外，其他3種酶受到恩諾沙星的影響較大。胃蛋白酶活性與恩諾沙星濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，于5 mg/L處理下即顯著降低，說(shuō)明中濃度恩諾沙星處理即已對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)的胃組織產(chǎn)生不利影響，致使胃蛋白酶活性受抑制，從而抑制其蛋白消化功能。而胰蛋白酶、脂肪酶活性變化趨勢(shì)類(lèi)似，于5 mg/L處理下即顯著高于對(duì)照組，且隨濃度升高呈下降趨勢(shì)。這可能是由于胰蛋白酶有限制酶原分解、活化的作用[27]，機(jī)體內(nèi)通過(guò)分泌胰蛋白酶來(lái)抑制胃蛋白酶原的分解，所以胃蛋白酶隨恩諾沙星濃度升高而降低。脂肪酶活性的升高可能是由于機(jī)體需要更多能量來(lái)消除恩諾沙星對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響，這與尹飛等[28]研究的低溫脅迫促使脂肪酶活性升高的結(jié)果相一致。而隨處理濃度的繼續(xù)升高，各消化酶活性均呈下降趨勢(shì)，結(jié)果表明高濃度恩諾沙星處理在一定程度上抑制了機(jī)體的消化性能，繼而對(duì)其攝食活性產(chǎn)生消極影響?；诙髦Z沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性影響的研究結(jié)果表明，不同消化酶應(yīng)對(duì)恩諾沙星應(yīng)激的變化規(guī)律不一致，這可能與各消化酶主要功能及個(gè)體的食性相關(guān)，眼斑雙鋸魚(yú)為雜食偏肉食性魚(yú)類(lèi)，進(jìn)一步證實(shí)了在藥物應(yīng)激下，個(gè)體胃蛋白酶活性反應(yīng)最強(qiáng)烈，胰蛋白酶及脂肪酶次之，而淀粉酶最弱的結(jié)果。此外，部分消化酶如脂肪酶亦參與了抗氧化過(guò)程[29]，因此在某種程度上解釋了，恩諾沙星對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)脂肪酶的影響程度較淀粉酶更強(qiáng)烈的現(xiàn)象。

3.3 恩諾沙星浸泡對(duì)眼斑雙鋸魚(yú)氧化產(chǎn)物含量的影響

氧化產(chǎn)物的含量反映了機(jī)體受毒害損傷的程度[30]。MDA含量反映膜質(zhì)氧化的程度[31]，同時(shí)也是LPO鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的最終產(chǎn)物[32]。在Suna等[33]對(duì)大鼠口服硫丹的研究中，6周后個(gè)體心臟MDA含量升高。在 Atif等[34]對(duì)翠鱧的研究中，個(gè)體硫丹暴露24 h后，個(gè)體各組織LPO含量升高。本試驗(yàn)中，眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)肝臟MDA及LPO含量隨恩諾沙星濃度的升高呈升高趨勢(shì)，二者均在10 mg/L處理下活性最大，不同的是MDA含量于10 mg/L處理下與對(duì)照組差異顯著，而LPO在5 mg/L即顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，個(gè)體在恩諾沙星浸泡應(yīng)激下，肝臟積累了大量氧化產(chǎn)物，尤其是高濃度處理下氧化產(chǎn)物含量更高，結(jié)果表明此時(shí)抗氧化系統(tǒng)正在運(yùn)作。至于機(jī)體所能承受的最大氧化產(chǎn)物（如 MDA、LPO）含量有待進(jìn)一步研究，相關(guān)研究結(jié)果有助于判定在該試驗(yàn)所設(shè)定處理濃度下，個(gè)體機(jī)體肝臟是否受到損傷及損傷程度。

4 結(jié)論

恩諾沙星作為最具代表的有效抗生素藥物而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，但其在使用時(shí)需針對(duì)不同的物種探索最適藥用量才能達(dá)到最佳治療效果，在消除病害的同時(shí)，把對(duì)個(gè)體組織的損傷控制在最小程度。本試驗(yàn)中，根據(jù)個(gè)體免疫酶、消化酶活性及氧化產(chǎn)物對(duì)恩諾沙星的應(yīng)激反應(yīng)綜合分析得出，就眼斑雙鋸魚(yú)幼魚(yú)而言，最佳藥用量應(yīng)控制在5 mg/L以內(nèi)，具體最適藥用量還需進(jìn)一步探索。