繡球菌對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

張作法，王富根，陳建飛，呂國(guó)英*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千島湖興寶菇業(yè)專業(yè)合作社，浙江 淳安 311701；3.衢州菇樂(lè)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 衢州 324000)

繡球菌(Sparassiscrispa)屬菌物界，擔(dān)子菌門，傘菌綱，多孔菌目，繡球菌科，也叫花椰菜菌、繡球蘑、地花蘑等。幼嫩的繡球菌子實(shí)體潔白細(xì)嫩、鮮美可口，野生分布較廣，我國(guó)主要分布在黑龍江、吉林、西藏、云南、河北、福建、廣東等林區(qū)中的云杉、冷杉或松林及混交林中；國(guó)外主要分布在日本、英國(guó)、美國(guó)、加拿大和澳大利亞等地。20世紀(jì)90年代繡球菌人工栽培在日本首獲成功，被譽(yù)為夢(mèng)幻神奇之菇，并進(jìn)入商業(yè)性生產(chǎn)。

近年來(lái)，隨著繡球菌人工栽培的成功，全球掀起了繡球菌的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用和研究熱潮，不少與其相關(guān)的產(chǎn)品已經(jīng)面世。我國(guó)對(duì)繡球菌的研究起步較晚，僅涉及繡球菌生物學(xué)特性、保鮮和人工栽培技術(shù)方面的研究[1-3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌具有抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、促進(jìn)傷口愈合[8]等廣泛的藥理活性。然而，繡球菌的諸多研究特別是開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面尚屬空白。本研究比較了繡球菌水提物對(duì)4種常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞(人肺癌A549、人胃癌SGC-7901、人胰腺癌PANC-1和人肝癌HepG2)的抑制作用，以期為繡球菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和耗材

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)AD20616263)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司，批號(hào)8118196)，1640培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司，批號(hào)8117177)，胎牛血清(杭州四季青公司，批號(hào)18040302)，胰酶(美國(guó)gibco公司，批號(hào)1953147)，MTT(ST316)，PBS(C0221A)和DMSO (ST038)均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 瘤株

人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.3 水提物

水提物制備：稱取適量干燥繡球菌粉，置于圓底燒瓶中，加入50倍體積的蒸餾水，置于90 ℃的水浴鍋內(nèi)浸提3 h，離心后，合并提取液。并將提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至200 mg·mL-1，高溫高壓滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器

BS124S電子天平，美國(guó)賽多利斯公司；DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TDL-40C低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Thermo 3111培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛公司；Synergy-2 SLFPA全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司；DMI3000B倒置顯微鏡，美國(guó)萊卡公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

選擇4種人腫瘤細(xì)胞(人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞A549)，采用DMEM培養(yǎng)基或RPMI1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。MTT法[9]檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的存活率：調(diào)整細(xì)胞為5×104mL-1，100 μL·孔-1接種于96孔板中。設(shè)立空白組、正常對(duì)照組、系列不同濃度藥物組，每孔加入含藥物培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24和48 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫置于搖床10 min，于酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定D值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。增殖抑制率(%)=1-(D樣品-D空白)/(D對(duì)照-D空白)×100。同時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)采用物鏡20×，拍照記錄各組細(xì)胞形態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異，樣本數(shù)n≥3。

2 結(jié)果與分析

繡球菌水提物在0～6.4 mg·mL-1劑量下24和48 h時(shí)對(duì)4種腫瘤細(xì)胞存活率的影響，MTT結(jié)果如表1、表2所示。24 h時(shí)，當(dāng)繡球菌多糖濃度在1.2 mg·mL-1時(shí)人胃癌SGC-7901細(xì)胞存活率與人胰腺癌PANC-1細(xì)胞接近，隨著濃度升高對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，均強(qiáng)于人肝癌HepG2和人肺癌A549。48 h時(shí)，當(dāng)繡球菌多糖濃度在0.4 mg·mL-1時(shí)，人胃癌SGC-7901與人胰腺癌PANC-1細(xì)胞存活率均與正常組有顯著性差異，隨著濃度升高對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用高于人胰腺癌PANC-1細(xì)胞。

表1 繡球菌水提物在24 h時(shí)對(duì)4種腫瘤細(xì)胞抑制率的影響 單位：%

注：*、**分別表示與空白對(duì)照相比，差異達(dá)顯著(P<0.05)、極顯著水平(P<0.01)。表2同。

表2 繡球菌水提物在48 h時(shí)對(duì)4種腫瘤細(xì)胞抑制率的影響 單位：%

隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，光鏡下觀察人肺癌A549和人胃癌SGC-7901細(xì)胞數(shù)量減少，皺縮，變圓，貼壁不緊密，部分脫落，形態(tài)損傷程度逐漸加深(圖1～4)。繡球菌水提物濃度在6.4 mg·mL-1時(shí)作用48 h，對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抑制率約89%，人肺癌A549約32%，人胰腺癌PANC-1約68%，人胃癌SGC-7901約49%。48 h時(shí)，繡球菌多糖對(duì)人肺癌A549和人胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50分別為5.016和6.981 mg·mL-1。

可見(jiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下，高濃度時(shí)，繡球菌水提物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用由強(qiáng)到弱依次表現(xiàn)為：人肺癌A549>人胃癌SGC-7901>人胰腺癌PANC-1>人肝癌HepG2；低濃度時(shí)，繡球菌多糖對(duì)人胃癌SGC-7901的抑制作用強(qiáng)于人肺癌A549細(xì)胞。

A～H依次表示0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4 mg·mL-1。圖2～4同。圖1 繡球菌水提物24 h對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901光鏡下形態(tài)的影響(200×)

圖2 繡球菌水提物48 h對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞光鏡下形態(tài)的影響(200×)

圖3 繡球菌水提物24 h對(duì)人肺癌A549細(xì)胞光鏡下形態(tài)的影響(200×)

圖4 繡球菌水提物48 h對(duì)人肺癌A549細(xì)胞光鏡下形態(tài)的影響(200×)

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一，為全球人類死亡的第二大原因。目前藥物治療是腫瘤綜合治療的重要手段之一。從天然動(dòng)植物或菌類中提取的天然活性物質(zhì)是抗癌藥物的重要來(lái)源。MTT法是1983年Mosmann提出的用于快速測(cè)量細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性及細(xì)胞毒性的方法，因其價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單靈敏而被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選[10]。菌類食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值介于動(dòng)物性食品和植物性食品之間，兼具動(dòng)物食品的高蛋白和植物食品的低脂肪的優(yōu)點(diǎn)。隨著社會(huì)的進(jìn)步和國(guó)民生活水平的提高，人們對(duì)飲食的綠色、天然和保健功能的追求越來(lái)越高，綠色、天然、功能性菌類食品越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。

繡球菌香味怡人，口感鮮美，是國(guó)內(nèi)外美食家公認(rèn)的山珍美味。同時(shí)其營(yíng)養(yǎng)、保健價(jià)值高，富含β-葡聚糖、腺嘌呤核苷、麥角固醇、超氧化物歧化酶等多重營(yíng)養(yǎng)成分，因而具有強(qiáng)身健體、防癌抗癌的特殊功能，同時(shí)具有抗衰老、美容等功效，對(duì)高血壓、糖尿病等疾病的預(yù)防及改善有很大的作用，是一種藥食兼用的珍稀菌類。

葡聚糖是由葡萄糖單體聚合而成的多糖，分為α型和β型，α型葡聚糖作為機(jī)體能量的主要來(lái)源，不具備生物活性。β型葡聚糖是一種生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性。多糖是繡球菌中的主要活性物質(zhì)，據(jù)日本食品分析中心報(bào)道，繡球菌中的β型葡聚糖含量達(dá)到43.6%，比靈芝和姬松茸高出3～4倍，其含量為菇類之最。

目前對(duì)于繡球菌的抗腫瘤作用已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，Hasegawa等[11]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌粉能夠顯著減小荷瘤S-180小鼠的肉瘤大小，且生命延長(zhǎng)。Ohno等[12]對(duì)14例癌癥患者進(jìn)行口服繡球菌粉臨床實(shí)驗(yàn)，其中9例病人病情得到了緩解。Harada等[13]發(fā)現(xiàn)，繡球菌β-葡聚糖對(duì)肺癌、乳腺癌、胃癌等有明顯的抑制作用。Yamamoto等[14]發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖能夠有效抑制血管生成和轉(zhuǎn)移。同時(shí)有研究還表明，繡球菌多糖的抗腫瘤機(jī)制是刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)對(duì)抗腫瘤[15]。宋文榮等[16]研究了繡球菌超細(xì)粉能夠通過(guò)改善機(jī)體免疫力和抗氧化作用來(lái)達(dá)到對(duì)H22荷瘤小鼠的抑制作用。于韋韋[17]發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖能通過(guò)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并通過(guò)誘導(dǎo)免疫因子的分泌實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷。Rui等[18]研究表明，用繡球菌具有良好的抗腫瘤效果。Kim等[19]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌的葡聚糖能夠通過(guò)激活巨噬細(xì)胞和樹(shù)狀突細(xì)胞來(lái)提高抗腫瘤效果。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，繡球菌水提物對(duì)不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，其中對(duì)人肺癌A549細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，對(duì)人肝癌HepG2抑制作用最弱，表明其具有一定的組織選擇性。據(jù)測(cè)定，繡球菌中的β葡聚糖含量達(dá)到了40%以上，而水提物中以多糖類物質(zhì)為主，考慮到β-葡聚糖卓越的藥理活性，所以水提物中的β-葡聚糖起到重要的作用。由于水提物成分復(fù)雜，具體起作用活性物質(zhì)的鑒定及抗腫瘤的作用機(jī)理將是下一步研究的重點(diǎn)。