300 mM高滲鹽溶液對重度燙傷大鼠腎損傷的影響

王 彪 袁春雨 王沁澄 田播文 孫業(yè)祥

燒傷后的低血容量性休克極易引發(fā)腎功能急劇下降或急性腎功能衰竭。相關(guān)文獻報道，成年燒傷患者早期急性腎損傷 （acute kidney injury，AKI）的發(fā)生率高達53.3%［1］，而合理的液體復(fù)蘇能夠減少腎損傷的發(fā)生［2］。研究顯示，傳統(tǒng)采用的乳酸鈉林格注射液 （LR）雖可有效幫助重度燒傷患者度過休克期，但卻存在增加低鈉血癥、組織水腫、腹腔間隔室綜合征及免疫功能紊亂等并發(fā)癥發(fā)生率的風(fēng)險［3-4］；而高滲鹽溶液 （HS，鈉離子濃度為240～300 mmol／L）不但能夠達到預(yù)期的復(fù)蘇效果，而且還可降低患者的液體負荷及炎癥反應(yīng)程度，減輕臟器損傷［5-7］，且部分研究證實，高滲鹽溶液可改善燒傷大鼠的肺損傷和腸損傷［8-9］。為此，筆者進一步研究了HS對重度燙傷大鼠腎損傷的影響，以期為HS的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康雌性SD大鼠56只，體重 （230±15）g，均由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物實驗的倫理學(xué)要求。

中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白 （neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、 白細胞介素-6 （IL-6）、 高遷移率族蛋白 B1（high mobilitygroup bo1，HMGB1）試劑盒，以及p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases， p38 MAPK）相關(guān)抗體均由北京蒂諾奧生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 模型建立與分組

大鼠于實驗室中自由進食水，飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)表法隨機分為假傷組 （8只）、LR組 （24只）與HS組 （24只）。其中假傷組大鼠于10%水合氯醛 （0.3 g／kg）腹腔注射麻醉、背部脫毛及尾靜脈置管處理后，背部脫毛處用溫水做假傷處理后直接處死；LR組大鼠于10%水合氯醛 （0.3 g／kg）腹腔注射麻醉、背部脫毛及尾靜脈置管處理后，背部脫毛處用95～100℃熱水浸泡，建立面積為30%TBSA、深度為Ⅲ度 （經(jīng)病理學(xué)檢測，符合Ⅲ度燙傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)）的燙傷模型，并根據(jù)Parkland公式［8］計算補液量進行LR復(fù)蘇；HS組大鼠于燙傷模型建立 （方法同LR組）后，根據(jù)Parkland公式計算補液量進行 300 mmol／L（mM）HS（1L 300 mM HS含97 mL 10%NaCl和903 mL LR）復(fù)蘇。

1.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

假傷組大鼠處死后取腎臟組織及腹主動脈血備用；LR組及HS組分別于復(fù)蘇2、8、24 h后各取8只大鼠處死后取腎臟組織及腹主動脈血備用。

1.3.1 腎臟組織濕干重比值 （W／D）測定 大鼠腎臟組織于生理鹽水沖洗、濾紙吸干水分后稱取濕重；稱取濕重后將組織標(biāo)本放入75℃烤箱內(nèi)烘烤72 h后取出稱取干重；最后，計算腎臟組織W／D，并予以對比。

1.3.2 p38 MAPK水平檢測 采用Western blot法對大鼠p38 MAPK的水平進行檢測：將腎臟組織置于冰浴條件下，按照試劑盒說明書提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上行5%脫脂牛奶封閉、p38 MAPK相關(guān)抗體4℃孵育過夜、二抗結(jié)合孵育及曝光顯影，最后采用Image J軟件分析目標(biāo)條帶，以磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）與p38 MAPK比值表示p38 MAPK通道活化程度。

1.3.3 血液指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測腹主動脈血肌酐 （Cr）水平；按照試劑盒說明書采用ELISA法測定腹主動脈血血清NGAL、TNF-α、IL-6及HMGB1水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s） 表示，采用單因素方差分析和q檢驗；均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟組織W／D及p38 MAPK通道活

化程度對比

與假傷組對比，LR組及HS組大鼠傷后2、8、24 h腎臟組織W／D及p38 MAPK通道活化程度均較高，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與LR組對比，HS組大鼠傷后2、8、24 h腎臟組織W／D及p38 MAPK通道活化程度均較低，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （表1）。Western bolt法檢測各組大鼠腎臟組織p-p38 MAPK及p38 MAPK水平條帶見圖1。

2.2 各組大鼠血液指標(biāo)對比

與假傷組對比，LR組及HS組大鼠傷后2、8、24 h血清Cr水平均較高，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。LR組與HS組大鼠傷后2 h血清Cr水平對比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而傷后8、24 h，HS組大鼠血清Cr水平均低于LR組，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （表1）。

與假傷組對比，LR組及HS組大鼠傷后2、8、24 h血清 NGAL、TNF-α、IL-6水平均較高，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。HS組大鼠傷后2、8、24 h血清 NGAL、TNF-α、IL-6水平均低于LR組，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （表1）。

與假傷組對比，LR組及HS組大鼠傷后2 h血清HMGB1水平相同，P均＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而傷后8、24 h血清HMGB1水平均較高，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。LR組與HS組大鼠傷后2 h血清HMGB1水平對比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而傷后8、24 h，HS組大鼠血清HMGB1水平均低于LR組，P均＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （表1）。

3 討論

研究顯示，燒傷面積超過30%TBSA的患者可出現(xiàn)細胞外液、血漿白蛋白的大量丟失，進而誘發(fā)低血容量性休克、低蛋白血癥而損傷腎臟功能，導(dǎo)致腎功能衰竭的發(fā)生［10-11］。而早期大量補充等滲晶體溶液雖能快速恢復(fù)循環(huán)血量，但也可加重臟器負擔(dān)，引發(fā)組織水腫、低鈉血癥等并發(fā)癥。HS作為一種單一滲透劑，可減輕機體負擔(dān)，緩解臟器損傷［12-13］，鑒于此，筆者于本研究中探討了其對重度燙傷大鼠腎損傷的影響。結(jié)果顯示，重度燙傷大鼠應(yīng)用HS后，腎臟干濕重比、p38 MAPK通道活化程度及部分炎癥介質(zhì)的表達水平雖較正常大鼠升高，但均明顯低于應(yīng)用LR治療者，可見HS可減輕腎損傷。

Cr主要由腎小球濾過排出，當(dāng)腎臟發(fā)生損傷時，可出現(xiàn)不同程度的Cr升高，因此Cr可作為反映腎功能的指標(biāo)。NGAL在正常腎組織中處于低表達狀態(tài)，急性缺血早期NGAL顯著升高并對腎臟起到保護作用，因此，其高表達亦可作為腎損傷的標(biāo)志［14-15］。本研究結(jié)果顯示，LR組及HS組大鼠血清Cr及NGAL水平均顯著高于假傷組，但HS組大鼠血清Cr及NGAL水平均顯著低于LR組，表明HS可有效減輕腎臟的損傷程度［16］。

嚴(yán)重?zé)齻螅瑱C體可產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致多器官功能衰竭。TNF-α是燒傷早期最重要的細胞因子，參與燒傷后炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)［17］；IL-6是燒傷急性期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)性細胞因子，可增強炎癥反應(yīng)程度，參與組織損傷和細胞死亡［18］；HMGB1作為轉(zhuǎn)錄增強核蛋白，能夠促進 Kupffer 細胞分泌 TNF-α［19-20］。 本研究結(jié)果顯示，LR組及HS組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均顯著高于假傷組，但HS組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均顯著低于LR組，表明HS可抑制TNF-α、IL-6、HMGB1的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)程度，與Du Z等的研究結(jié)果一致［21］。

表1 各組大鼠腎臟組織W／D、p38 MAPK水平及血液指標(biāo)對比 （±s）Table 1 Comparison of renal tissue W／D， p38 MAPK expression level， and blood indicators among the three groups （±s）

表1 各組大鼠腎臟組織W／D、p38 MAPK水平及血液指標(biāo)對比 （±s）Table 1 Comparison of renal tissue W／D， p38 MAPK expression level， and blood indicators among the three groups （±s）

注：F1、P1為假傷組、LR組傷后2 h及HS組傷后2 h各項指標(biāo)方差分析值；F2、P2為假傷組、LR組傷后8 h及HS組傷后8 h各項指標(biāo)方差分析值；F3、P3為假傷組、LR組傷后24 h及HS組傷后24 h各項指標(biāo)方差分析值。各時間點各項指標(biāo)兩兩對比，其中與假傷組對比，aP＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與LR組傷后2 h對比，bP＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與LR組傷后8 h對比，cP＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與LR組傷后24 h對比，dP＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義Note： F1and P1were the ANOVA values of indicators at 2 h after scalds in each group； F2and P2were the ANOVA values of indicators at 8 h after scalds in each group；F3and P3were the ANOVA values of indicators at 24 h after scalds in each group.The pairwise comparison of all indicators among the three groups at the three different time points all showed statistically significant differences（aP＜0.05，bP＜0.05，cP＜0.05，dP＜0.05）

組別Group時間Time （h）只數(shù)Number of rats W／D p38 MAPK通道活化程度Activation degree of p38 MAPK channel Cr（μmol／L）NGAL（ng／mL）TNF-α（pg／mL）IL-6（pg／mL）HMGB1（pg／mL）假傷組Sham group 0 8 3.25±0.16 0.327±0.023 31.14±2.26 37.24±4.33 60.04±6.24 2.90±0.16 0.05±0.01 LR組LR group傷后2 h 2 h after scalds 8 3.86±0.28a 0.930±0.049a42.38±7.46a 93.83±9.21a122.74±13.61a5.43±0.24a 0.05±0.01傷后8 h 8 h after scalds 8 4.27±0.22a 0.946±0.057a 49.56±4.81a 111.42±7.18a153.21±13.45a6.12±0.39a 0.39±0.05a傷后24 h 24 h after scalds 8 3.90±0.28a 0.885±0.025a42.58±3.95a 93.86±7.70a 85.25±9.70a 5.87±0.36a 0.59±0.07a HS組HS group傷后2 h 2 h after scalds 8 3.43±0.14ab 0.568±0.020ab40.85±5.44a 74.53±5.45ab 84.84±3.60ab4.25±0.30ab 0.05±0.01傷后8 h 8 h after scalds 8 3.69±0.16ac 0.734±0.018ac41.49±2.32ac 83.25±6.72ac 93.71±5.53ac4.54±0.35ac 0.14±0.01ac傷后24 h 24 h after scalds 8 3.42±0.12ad 0.693±0.036ad36.64±1.76ad 70.09±7.50ad 67.50±4.38ad4.36±0.21ad 0.31±0.03ad F1value 19.074 663.945 9.871 149.029 100.919 222.074 1.000 F1值F2value 63.068 578.990 60.851 291.466 213.314 207.254 275.852 F3值F3value 23.034 787.239 32.999 144.463 26.444 265.582 296.678 P1值P1value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.385 P2值P2value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 P3值P3value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 F2值

圖1 Western blot法檢測各組大鼠腎臟組織p-p38 MAPK及p38 MAPK水平條帶圖Fig.1 The expression levels of p-p38 MAPK and p38 MAPK in renal tissues of each group tested by the Western blot

MAPK信號級聯(lián)通路的活化對細胞生長、發(fā)育及死亡的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。p38 MAPK作為MAPK家族的重要成員之一，參與燒傷后炎癥介質(zhì)的生成。研究證實，p38 MAPK的激活是導(dǎo)致燒傷患者 TNF-α和 HMGB1升高的主要信號通路之一［22］；抑制p38 MAPK的活化可抑制IL-6和TNF-α mRNA的表達［23-24］。本研究結(jié)果顯示，LR組及HS組大鼠腎臟組織p38 MAPK通道活化程度均顯著高于假傷組，但HS組大鼠腎臟組織p38 MAPK通道活化程度顯著低于LR組，表明HS可抑制p38 MAPK的 活 化， 進 而 減 少 TNF-α、 IL-6、HMGB1等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕腎臟的炎性損傷。

綜上所述，HS可通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及下調(diào)p38 MAPK信號通路而減輕腎臟的損傷程度［25-26］，故燒傷后可早期應(yīng)用HS予以復(fù)蘇抗休克。