西藏昌都市藏族育齡婦女MTHFR和MTRR與不良妊娠結局關系的研究*

楊曉黎，鄭曉華，高玉蘭，彭佳瓊，四郎擁宗，劉欣雨

(1.西藏自治區(qū)昌都市人民醫(yī)院 854000；2.重慶三峽中心醫(yī)院 404100；3.解放軍第三二四醫(yī)院，重慶 400000)

葉酸也叫維生素B9，可參與人體內多種能量代謝的過程，對細胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質的合成均起到重要作用[1]。在胚胎形成和胎兒發(fā)育的過程中，人體對葉酸的需求會急速增加。為孕前及孕早期女性補充小劑量的葉酸可有效防止胎兒神經(jīng)管缺陷的發(fā)生[2]。為了加強出生缺陷干預方面的工作，降低胎兒神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率，近年來國家人口和計劃生育委員會及財政部共同實施了為孕產(chǎn)婦免費發(fā)放葉酸的工作[3]，我國多個省份也將“增補葉酸”列為其“婦幼重大公共衛(wèi)生服務項目”，并每年進行相關指標的績效考核。臨床實踐證實，圍生期女性增補葉酸的規(guī)范性與其是否接受有效的健康教育有密切的關系。

我國原衛(wèi)生部也于2009年6月啟動了“增補葉酸預防神經(jīng)管缺陷”重大公共衛(wèi)生項目，向農(nóng)村及城鎮(zhèn)婦女免費發(fā)放葉酸，目前已取得了顯著成效。但由于我國幅員遼闊，不同地區(qū)的生活習慣、飲食習慣乃至飲用水都有明顯差異，因此我國圍生期婦女每日補充多少劑量的葉酸才能實現(xiàn)所需水平，目前尚無統(tǒng)一定論，不同研究和不同地區(qū)的情況都不一致，需要多中心、大樣本量的研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計。本研究的目的在于分析西藏自治區(qū)昌都市藏族婦女亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點、MTHFR基因A1298C位點、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因A66G位點多態(tài)性在正常人群和有不良妊娠結局史人群的分布情況，以探討葉酸代謝基因與不良妊娠結局的關系，為該地域的人群預防出生缺陷制訂具有針對性的干預措施并提供有效的科學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取西藏自治區(qū)昌都市人民醫(yī)院的718例建卡及做孕期保健的藏族女性為研究對象，平均年齡28.3歲。在探究葉酸基因多態(tài)性與不良妊娠結局的關系中，以427例無不良妊娠結局史的婦女為對照組，以291例具有不良妊娠結局史如自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、子癇前期、死胎死產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、胎兒畸形、妊娠高血壓的婦女為病例組進行分組研究。所有受檢者均在簽署知情同意書后，通過提取口腔黏膜細胞中的DNA進行基因檢測，評估其葉酸利用能力。

1.2方法

1.2.1標本DNA采集 由經(jīng)過專業(yè)培訓的人員進行標本采集工作。使用專用的口腔黏膜上皮細胞采集器進行操作，提取受檢者的口腔黏膜上皮細胞，具體方法為：在口腔內一側上下刮拭40次以上，力量以略微鼓起為宜，然后利用柱式抽提試劑盒抽提標本的DNA。

1.2.2基因檢測 MTHFR基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點的SNP分型采用Taqman-MGB技術測定，相關儀器、試劑均使用美國Applied Biosystems(AB)公司產(chǎn)品。

1.2.3熒光定量PCR檢測 對3個位點同時進行熒光定量PCR反應，反應所用探針信息見表1。每個反應體系的總體積為10.0 μL，包含濃度為20 ng/μL的DNA模板1.0 μL，2×Taqman Universal Master Mix 5.0 μL，20×Taqman-MGB探針0.5 μL，去離子水3.5 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，20個循環(huán)擴增，再進行30個循環(huán)的擴增(80 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s)。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣品的基因分型結果。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗；采用HaploView4.2軟件進行Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡水平(LD)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗 本研究Hardy-Weinberg平衡校驗目的是驗證標本的可靠性。結果表明，收集到的西藏自治區(qū)昌都市藏族人群的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性分布情況符合遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體，標本具有區(qū)域代表性。

2.2基因型頻率分析 本研究對427例病例組和291例對照組進行基因型頻率分析，結果顯示兩組MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3等位基因分布情況 對427例病例組和291例對照組進行等位基因頻率分析，結果顯示兩組MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表1 Taqman-MGB探針所在位置

表2 兩組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點基因型頻率比較[n(%)]

表3 兩組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點等位基因頻率比較[n(%)]

2.4MTHFR基因兩位點單倍型分析及連鎖情況 西藏自治區(qū)昌都市藏族育齡婦女MTHFR基因C677T和A1298C兩位點的組合情況有6種可能。單倍型分析表明，存在3種組合：CA占74.8%，TC占21.3%，TA占3.9%。MTHFR基因C677T和A1298C兩位點存在較高程度的連鎖不平衡現(xiàn)象(D′=1.0，r2=0.803)，見表4。

2.5基因多態(tài)性與不良妊娠結局的關系 將291例病例組中不良妊娠結局細分為自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、子癇前期、死胎死產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、胎兒畸形和妊娠高血壓與對照組進行分析，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)患者MTHFR C677T基因多態(tài)性的分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.89,P<0.05)，見表5，其等位基因的分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.67,P<0.05)，見表6。

表4 MTHFR基因C677T和A1298C位點連鎖型分布[n(%)]

表5 兩組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性位點分布比較[n(%)]

a：P<0.05，與對照組比較

表6 兩組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性位點等位基因分布比較[n(%)]

續(xù)表6 兩組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性位點等位基因分布比較[n(%)]

a：P<0.05，與對照組比較

2.6MTHFR基因型與早產(chǎn)的Logistic分析 通過單因素分析發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)與MTHFR C677T基因型具有相關性(χ2=12.89,P<0.05)。以MTHFR C677T基因型為自變量(CC型=1，CT型=2，TT型=3)，早產(chǎn)為因變量作Logistic回歸分析，結果顯示CT型OR=1.83，95%CI為0.80～4.19(P=0.153)；TT型OR=5.73，95%CI為2.05～16.00(P=0.001)。

3 討論

葉酸是人體所需的重要營養(yǎng)素，屬于B族維生素。葉酸在體內被還原成具有生理活性的5-甲基四氫葉酸(活性葉酸)，作為一碳單位的供體，主要參與DNA氧化損傷修復、細胞增殖及組織生長過程[4-5]。在葉酸代謝通路中，有多種酶共同參與了葉酸的轉運和代謝，其中MTHFR、MTRR為葉酸代謝的關鍵酶，MTHFR和MTRR基因在自然人群中存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其突變可引起酶活性的改變[6]，并造成葉酸代謝的異常，使得活性葉酸水平降低[7]及同型半胱氨酸(Hcy)水平升高[8-9]。

據(jù)報道，MTHFR和MTRR基因突變與多種出生缺陷相關。早有研究證實母親MTHFR 677C>T和MTRR 66A>G位點多態(tài)性是子代發(fā)生神經(jīng)管畸形的危險因素[10-11]。LI等[12]通過Meta分析，指出MTHFR 677C>T多態(tài)性是先天性心臟病發(fā)生的危險因素。WU等[13]Meta分析結果表明，亞洲婦女攜帶MTHFR基因677T位點等位基因增加唐氏綜合征患病風險(OR=1.75，95%CI：1.084～2.824，P=0.022)。MTHFR基因C677T位點多與人體內葉酸缺乏及其各種癥狀直接相關，而MTHFR A1298C和MTRR基因A66G位點更偏向于通過影響血漿Hcy水平而間接影響人體代謝。本研究在進行相關分析的時候也支持了這一點，即在西藏昌都市育齡婦女的葉酸代謝基因多態(tài)性與不良妊娠結局分析中，兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明西藏昌都市育齡婦女的葉酸代謝基因多態(tài)性與總不良妊娠結局無相關性。值得注意的是，將不良妊娠結局的因素進行具體劃分，發(fā)現(xiàn)病例組早產(chǎn)婦女MTHFR C677T基因多態(tài)性與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與已有的研究報道不同，推測這與本研究樣本量較小有關。另外，為了進一步揭示該地區(qū)人群中MTHFR基因C677T位點與早產(chǎn)發(fā)生之間的聯(lián)系，從而進行了Logistic分析，發(fā)現(xiàn)TT型OR=5.73，95%CI為2.05～16.00(P<0.05)，表明西藏昌都市育齡婦女的C677T TT型是導致早產(chǎn)發(fā)生的風險因素，其發(fā)生早產(chǎn)的風險是野生型的5.73倍，提示在今后的臨床診療中，應關注葉酸基因的缺陷情況，并提供相關的葉酸補服建議。

此外，值得注意的是，西藏地處“世界屋脊”青藏高原，其獨特的地理位置造就了當?shù)亻L期困難的交通和相對與世隔絕的生活習慣。在一項較小樣本量的研究中就曾指出，西藏藏族女性C677T位點TT基因型頻率顯著低于漢族女性[14]。因此，推測葉酸基因多態(tài)性分布可能呈現(xiàn)與全國其他民族不同的個性化趨勢。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)西藏昌都市藏族婦女的MTHFR基因C677T位點TT基因型頻率為6.32%，低于文獻報道中的思南苗族[15](12.9%)、延邊朝鮮族[16](18.8%)、銀川回族[17](16.5%)、新疆維吾爾族[18](10.9%)、張家界土家族[19](14.6%)，高于南寧壯族[20](5.1%)、烏蘇哈薩克族[21](5.0%)，總體上呈現(xiàn)MTHFR基因A1298C位點上的C等位基因頻率從北到南整體逐漸升高的趨勢。根據(jù)以上數(shù)據(jù)對比可以看出，不同民族MTHFR、MTRR的基因多態(tài)性分布有所不同，其分布具有民族特異性。

本文通過開展對西藏昌都市藏族婦女MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與不良妊娠結局關系研究，可了解西藏昌都市藏族婦女個性化的基因分布特點，揭示了不良妊娠結局與葉酸代謝基因的關系，可指導醫(yī)務工作者采取個性化的圍產(chǎn)干預措施，減少出生缺陷的發(fā)生。但本研究同時存在不足，如樣本量較小，關于葉酸基因多態(tài)性與不良妊娠結局之間的機制也待進一步探索。