三七總皂苷紅花提取物復(fù)方配伍對心肌缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用＊

李穎慧，魏 蕓，程文豪，徐婷婷，張碩峰

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029）

心血管疾病是全球的頭號死因，據(jù)WHO 統(tǒng)計2015年全世界約有1770萬人死于心血管疾病，占全球死亡總數(shù)的31% 。其中，約有740 萬人死于冠心病[1]。心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，從而無法維持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)，是冠心病等多種心臟疾病的常見癥狀[2]。使用溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是減少心肌梗死面積并改善臨床癥狀的最有效策略，即通過對缺血的冠狀動脈進(jìn)行再灌注來治療缺血性心臟病[3]，但這種治療方式所引起的再灌注損傷卻是不能忽視的問題。隨著缺血性心臟病發(fā)病率的升高，如何在保證有效治療心肌缺血的同時減輕再灌注損傷也成為了研究的熱點。研究認(rèn)為心肌缺血再灌注的發(fā)生可能與鈣超載、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等相關(guān)。臨床上治療手段包括藥物預(yù)處理、缺血預(yù)處理和后處理等[4]。中藥有效成分和復(fù)方制劑在心血管疾病的治療上有著較好的效果，中藥多成分多靶點的特性也成為了中藥治療心肌缺血及再灌注損傷的優(yōu)勢所在，需要對其多靶點作用的機(jī)制進(jìn)行深入探究。

三七總皂苷是三七的主要活性成分，研究顯示三七總皂苷具有抗心肌缺血及再灌注損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗血小板異常活化等多種藥理作用[5]。紅花為常用的活血化瘀藥，臨床上多用于治療冠心病、心絞痛、婦科疾病、跌打損傷等[6]。在之前的研究中已證實，三七紅花配伍在改善血液流變學(xué)、抗心肌缺血、清除自由基等方面有較好效果[7-9]。重要的是，與三七或紅花單味藥提取物相比，三七紅花復(fù)方配伍在抑制缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和減少心肌梗塞面積方面表現(xiàn)出更顯著的效果[9]。本研究選用冠狀動脈結(jié)扎致大鼠心肌缺血模型及心肌缺血1 h再灌注72 h模型，通過檢測心肌梗塞范圍、心肌酶活性、心功能、炎癥因子、病理形態(tài)等指標(biāo)，探討三七紅花配伍復(fù)方對心肌缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用及其潛在的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220-240 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有公司提供。合格證號：11400700113732。

1.2 實驗藥品與試劑

三七總皂苷、紅花提取物：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部姜勇教授提供；通心絡(luò)膠囊（批號：A1405019）由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（批號均為20150110）均由南京建成生物工程研究所提供；大鼠LTB4 酶聯(lián)試劑盒（品牌：Bluegene，批號：20151109）；大鼠IL-1b酶聯(lián)試劑盒（批號：20151127）、大鼠IL-6 酶聯(lián)試劑盒（批號：20151108）、大鼠TNF-α酶聯(lián)試劑盒（批號：20151112）、大鼠IL-8 酶聯(lián)試劑盒（批號：20151120），品牌均為R&D，進(jìn)口分裝。

1.3 實驗設(shè)備

MedLab-U 多通道生理采集系統(tǒng)：南京美易科技有限公司產(chǎn)品；RM6240C 多通道生理采集系統(tǒng)：成都儀器廠產(chǎn)品；DW3000呼吸機(jī)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MULTISKAN MK3 全自動多功能酶標(biāo)儀：Thermo，USA；UV-2000紫外分光光度計：上海尤尼柯公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥

2.1.1 心肌缺血模型

大鼠隨機(jī)分為6 組：三七紅花復(fù)方高、中、低劑量（110、55、27.5 mg·kg-1）組、通心絡(luò)膠囊312 mg·kg-1組、模型組、假手術(shù)組。于造模前30 min 按劑量分別灌胃給藥一次，造模后6 h再灌胃給藥一次。假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量飲用水，給藥容積均為1 mL·100 g-1體質(zhì)量。

2.1.2 心肌缺血再灌注損傷模型

大鼠分組同前。于手術(shù)前30 min 灌胃給藥1 次，再灌注后飼養(yǎng)3 d，每天給藥一次，給藥容積均為1 mL·100 g-1。

2.2 造模方法

2.2.1 心肌缺血模型

大鼠灌胃給藥后，用10% 水合氯醛（350 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)口插氣管，連接呼吸機(jī)，呼吸頻率為60 次·min-1，潮氣量為6 mL。于大鼠左側(cè)第四肋間開胸，用6/0 手術(shù)線在肺動脈圓錐和左心耳交界下緣1-2 mm 結(jié)扎，假手術(shù)組只在左前降支相應(yīng)位置穿針而不打結(jié)，其余操作與手術(shù)組相同。手術(shù)后觀察10 min，待呼吸平穩(wěn)后，擠出胸腔內(nèi)氣體并逐層關(guān)胸，縫合傷口，拔出氣管插管并清除氣管內(nèi)分泌物，恢復(fù)大鼠自主呼吸，給予飼料和水喂養(yǎng)24 h。

2.2.2 心肌缺血再灌注損傷模型

用上述方法對大鼠進(jìn)行冠脈結(jié)扎，缺血1 h后再剪開結(jié)扎線恢復(fù)血流。造模后，給予飼料和水喂養(yǎng)72 h。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 急性心肌缺血指標(biāo)檢測

2.3.1.1 心肌梗塞范圍的測定

大鼠造模24 h 后，戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，取出心臟，用生理鹽水洗凈-20 ℃冷凍10 min。將心臟從結(jié)扎線下切成5 份，用1% TTC 磷酸鹽緩沖液在空氣震蕩浴中37 ℃染色，非梗塞區(qū)呈鮮紅色，梗塞區(qū)呈黃白色。用image-pro 圖像分析軟件分析，計算心肌梗塞體積占心肌總體積的百分比，表示心肌梗塞的范圍。

2.3.1.2 心肌缺血生化指標(biāo)的測定

大鼠采血后離心10 min（3500 r·min-1），取上清放入-80 ℃冰箱凍存，按試劑盒說明書測定LDH、CKMB、AST活性。

2.3.2 心肌缺血再灌注損傷指標(biāo)檢測

2.3.2.1 心肌缺血再灌注損傷心功能檢測

再灌72 h 后，戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，背位固定大鼠，經(jīng)大鼠右側(cè)頸總動脈插管至左心室，連接壓力換能器，使用MedLab-U生物信號采集系統(tǒng)記錄10 min，測定大鼠左心功能。

2.3.2.2 IL-1β、IL-6、IL-8、LT-B4、TNFα含量檢測

左心功能測定完畢后，迅速取出心臟，置于生理鹽水中沖洗，去除心臟內(nèi)污血以及非心肌組織如血管、脂肪等，取左心室前壁心肌組織勻漿置于-80 ℃冰箱，按試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、IL-8、LT-B4、TNF-α含量。

2.3.2.3 心肌組織病理學(xué)分析

將取下的心肌組織制作成石蠟切片后，HE染色觀察心肌組織的病理性損傷。

2.4 數(shù)據(jù)分析方法

用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理，組間均數(shù)的比較采用t檢驗，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗。計量資料Xˉ±SD表示。

表1 三七紅花復(fù)方對冠脈結(jié)扎致心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響

表1 三七紅花復(fù)方對冠脈結(jié)扎致心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 實驗結(jié)果

3.1 三七紅花復(fù)方對冠脈結(jié)扎致心肌缺血大鼠的作用

結(jié)果表明，三七紅花復(fù)方各劑量組均可不同程度地減少大鼠心肌梗塞范圍，其中三七紅花復(fù)方中、低劑量組的抗心肌梗塞作用與模型組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，各劑量組可不同程度地抑制模型大鼠血清AST、CK-MB、LDH 的升高，其中三七紅花復(fù)方高、中、低劑量組對模型大鼠血清AST、LDH 升高的抑制作用與模型組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），三七紅花復(fù)方中劑量組對模型大鼠血清CK-MB 升高的抑制作用明顯強(qiáng)于模型組（P<0.05），結(jié)果見表2。

3.2 三七紅花復(fù)方對心肌缺血1 h再灌注72 h 損傷大鼠的影響

結(jié)果表明，大鼠心肌缺血1 h 再灌注損傷72 h 后，大鼠心臟左心室收縮功能、舒張功能明顯降低，表現(xiàn)為LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 明顯低于假手術(shù)組（P<0.05）。三七紅花復(fù)方各劑量可不同程度抑制模型大鼠左心功能的下降，其中三七紅花復(fù)方高、中劑量組作用明顯強(qiáng)于模型組（P<0.05），結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，大鼠心肌缺血1 h再灌注損傷72 h 后，大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4 含量顯著高于假手術(shù)組（P<0.01）。三七紅花復(fù)方各劑量可不同程度抑制模型心肌組織TNF-α、LT-B4含量的升高，其中三七紅花復(fù)方高劑量組抑制TNF-α含量升高作用強(qiáng)于模型組（P<0.05），抑制LT-B4含量升高作用顯著強(qiáng)于模型組（P<0.01），結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，大鼠心肌缺血1 h再灌注損傷72 h 后，大鼠心肌組織IL-1β含量高于假手術(shù)組（P<0.05）、IL-6 和IL-8 含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）。三七紅花復(fù)方各劑量可不同程度抑制大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8含量的升高，其中三七紅花復(fù)方高劑量組對IL-1β、IL-6含量升高的抑制作用與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P< 0.05），結(jié)果見表5。組織學(xué)檢測表明，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，未見心外膜血管充血，心肌組織細(xì)胞排列正常，心肌纖維未見斷裂，心肌細(xì)胞未見萎縮、肥大，未見心肌細(xì)胞水腫、局部肌凝等變性或壞死性變化，心肌纖維間未見充血、水腫和炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠與假手術(shù)組對比，大鼠心肌均出現(xiàn)不同程度（梗塞范圍）的缺血缺氧損傷性變化，在左心室前壁、側(cè)壁、室間隔部位出現(xiàn)不同程度的大片梗塞區(qū)，其中央1/3 區(qū)域可見蒼白色出血壞死，周圍2/3 區(qū)域可見中性白細(xì)胞為主的炎細(xì)胞密集浸潤。三七紅花復(fù)方的各劑量可明顯減輕缺血再灌注所造成的損傷，不同程度減少大鼠心肌梗塞灶的數(shù)量和范圍，在左心室前壁或室間隔部位心肌出現(xiàn)小片梗塞區(qū)，梗死區(qū)內(nèi)可見中性白細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤（圖1）。

表2 三七紅花復(fù)方對冠脈結(jié)扎致心肌缺血大鼠血清AST、CK-MB、LDH活性的影響（

表2 三七紅花復(fù)方對冠脈結(jié)扎致心肌缺血大鼠血清AST、CK-MB、LDH活性的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3 三七紅花復(fù)方對心肌缺血1 h再灌注損傷72 h后大鼠心功能的影響（

表3 三七紅花復(fù)方對心肌缺血1 h再灌注損傷72 h后大鼠心功能的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表4 三七紅花復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4的影響（

表4 三七紅花復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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表5 三七紅花復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8的影響（

表5 三七紅花復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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圖1 三七紅花對心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的病理觀察（HE染色，10×）

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心肌缺血屬于“胸痹”的范疇，與胸痹最密切相關(guān)的病因病機(jī)是氣虛和血瘀，治療心肌缺血應(yīng)該從中醫(yī)的角度去辨證論治，活血化瘀是治療心肌缺血主要途徑。三七和紅花為治療心腦血管疾病的常用藥物，三七紅花均為活血化瘀藥。因此，三七紅花配伍治療心肌缺血類疾病符合中醫(yī)相須配伍原則。在本課題組前期實驗中，單用60 mg·kg-1三七總皂苷及單用50 mg·kg-1紅花提取物均能縮小急性心肌缺血后心肌梗塞范圍，使用110 mg·kg-1三七紅花復(fù)方配伍（三七總皂苷與紅花提取物按6∶5 配伍）能顯著縮小急性心肌缺血后心肌梗塞范圍，提示兩者配伍使用可增強(qiáng)抗心肌缺血的作用。三七和紅花抗心肌缺血的作用既有相同點又各有側(cè)重，有研究表明，三七總皂苷可抑制NF-κB 的活性，抑制中性粒細(xì)胞活化黏附[10]。紅花通過抑制PAF 與其受體的特異性結(jié)合，從而抑制PAF 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的聚集和黏附[11-12]。因此，三七和紅花配伍應(yīng)用與單用相比，其作用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，可有效加強(qiáng)抗心肌缺血及再灌注損傷的作用。

心肌缺血造成心肌組織壞死，心肌酶從心肌細(xì)胞漏出，導(dǎo)致血清中各種心肌酶的活性升高，檢測血清中心肌酶活性有助于心肌損傷的快速診斷。肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）在心肌缺血早期即可在血清中檢測出來，特異性和靈敏度較高，可用于急性心肌缺血的早期診斷[13]。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）在血清中出現(xiàn)的時間較CK和CK-MB晚，但持續(xù)時間長，可以在心肌缺血發(fā)生的中后期檢測出來[14]。本研究選擇CK-MB、AST 和LDH 來判斷心肌損傷程度并評估三七紅花復(fù)方抗心肌缺血損傷的療效，結(jié)果顯示三七紅花復(fù)方中、低劑量在造模后24 h 給藥兩次可明顯減少大鼠心臟梗塞范圍，并抑制模型大鼠血清AST、CK-MB、LDH 的升高，表明三七紅花復(fù)方對缺血心肌具有保護(hù)作用。

當(dāng)缺血區(qū)的血流再次恢復(fù)時，再灌注損傷的產(chǎn)生會使得心肌組織損傷程度加深，并將在缺血損傷期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆損傷細(xì)胞[15]。心肌缺血及再灌注會損害左心室收縮和舒張功能，引起一系列血流動力學(xué)變化，如心肌收縮力和順應(yīng)性降低，每搏輸出量減少和左心室舒張末期壓力增加[16]。左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax），主要反映左心室的舒張功能；左心室收縮壓（LVSP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax），主要反映左心室的收縮功能，表現(xiàn)為LVSP 越高，左心室收縮力越好。檢測心肌缺血再灌注損傷大鼠的心功能可顯示LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 明顯降低[17]。三七紅花復(fù)方各劑量可不同程度抑制模型大鼠左心功能的下降，其中高、中劑量組可明顯改善大鼠心臟收縮與舒張功能。

隨著近年對心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的深入研究，過度的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。由于心肌組織損傷和組織壞死，病變心肌中可見中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤，此時血清中各種炎癥性細(xì)胞因子水平升高，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白三烯（LT-B4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥標(biāo)志物[18]，這些炎性細(xì)胞因子的動態(tài)變化和濃度還可能與組織損傷的時間及程度相關(guān)[18]，同時阻斷炎癥通路也為心肌缺血及再灌注的治療提供了思路[19-21]。本研究以炎性因子作為評價心肌缺血再灌注損傷的指標(biāo)，來綜合評價三七紅花復(fù)方抗心肌缺血再灌注損傷的作用。結(jié)果顯示，三七紅花復(fù)方高劑量組可明顯抑制模型大鼠心肌TNF-α、LT-B4、IL-1β、IL-6 的升高。病理結(jié)果顯示，三七紅花復(fù)方各劑量組與模型組比較心肌的梗死灶的范圍明顯變小。表明三七紅花復(fù)方可抑制心肌缺血與再灌注損傷所引起的炎癥反應(yīng)，對心肌缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用。

綜上所述，三七紅花復(fù)方對心肌缺血和心肌缺血再灌注損傷均可起到一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與抗炎癥反應(yīng)有關(guān)，為三七紅花復(fù)方配伍治療缺血性心臟病提供了理論依據(jù)。但是結(jié)果也顯示出三七紅花復(fù)方治療心肌缺血及再灌注損傷時量效關(guān)系并不明顯，對心肌缺血有顯著改善效果的劑量在作用于缺血再灌注損傷時部分指標(biāo)沒有得到顯著的改善，分析可能與再灌注造成的心肌損傷加重或中藥量效關(guān)系的復(fù)雜性有關(guān)，單味藥的有效劑量在復(fù)方中受到配伍藥物的影響可能會出現(xiàn)作用減弱的情況[22]，因此對于三七紅花復(fù)方作用于心肌缺血/再灌注損傷的最佳劑量還需要深入探究。另外，可以通過監(jiān)測三七紅花復(fù)方對心肌缺血及再灌注損傷作用的動態(tài)變化，來探究該復(fù)方對心肌缺血及再灌注不同損傷時間和程度的作用效果，為臨床的合理應(yīng)用提供更多依據(jù)。

5 結(jié)論

三七紅花復(fù)方可抑制大鼠心肌缺血與再灌注損傷所引起的炎癥反應(yīng)，改善其心功能，提示該復(fù)方對于人體心肌缺血及再灌注損傷可能具有保護(hù)作用，本研究以期為臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。