單細(xì)胞RNA測(cè)序在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

陳麒麟 綜述 劉志紅 審校

DNA序列、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、RNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)和代謝物等大規(guī)模的組學(xué)研究，為生命與疾病過(guò)程進(jìn)行了豐富與全面的描述[1]。然而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(Bulk RNA-seq)只能應(yīng)用于由許多細(xì)胞組成的組織樣本，提供均值化宏觀數(shù)據(jù)的同時(shí)掩蓋單個(gè)細(xì)胞間的差異，缺乏針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)是一項(xiàng)獲取單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的研究方法，能夠從單個(gè)細(xì)胞層面進(jìn)行組織或器官的研究。隨著單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，2016年10月科學(xué)界正式發(fā)起了“人類細(xì)胞圖譜”(human cell atlas，HCA)的國(guó)際合作研究計(jì)劃，其基本目標(biāo)是采用特定的分子表達(dá)譜來(lái)確定構(gòu)成人體的所有細(xì)胞類型[2]。大規(guī)模scRNA-seq實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙勋@得了線蟲、蝸蟲、果蠅和小鼠大多數(shù)器官的細(xì)胞圖譜。在人類研究中，單細(xì)胞分析提高了對(duì)發(fā)育、老化和癌癥等不同病理改變的認(rèn)識(shí)[3]。

腎臟細(xì)胞的形態(tài)與功能存在較大異質(zhì)性。通過(guò)顯微微分離等方法已實(shí)現(xiàn)了腎小球與腎小管的區(qū)域性組學(xué)研究，證明了腎小球與腎小管細(xì)胞上的顯著差異[4]。但同一區(qū)域的腎臟細(xì)胞同樣存在明顯差異，如腎小球中終末分化狀態(tài)的上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)、維持血管基本結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍的系膜細(xì)胞或者組成腎小管各個(gè)節(jié)段的各種上皮細(xì)胞，都擁有獨(dú)特的形態(tài)特征，發(fā)揮各自特異的功能，在不同疾病中存在不同的損傷改變[5]。

scRNA-seq應(yīng)用于腎臟領(lǐng)域能夠極大地提高對(duì)于腎臟細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，本文就scRNA-seq技術(shù)的基本原理及其在腎臟疾病的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

scRNA-seq的基本技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是分析基因表達(dá)的有效方法，主要過(guò)程包括將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行高通量DNA測(cè)序，序列讀取的數(shù)量能反映樣本中基因的表達(dá)水平。scRNA-seq的基本原理與之類似，不同之處在于其針對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行研究，使其在單細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲技術(shù)、數(shù)據(jù)處理與分析中具有一定特殊性。

單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液中細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞內(nèi)RNA的完整性直接決定單個(gè)細(xì)胞的有效捕獲與研究結(jié)果的真實(shí)性。血液等天然單細(xì)胞懸液可經(jīng)過(guò)梯度離心等方法直接進(jìn)行單細(xì)胞懸液制備，而腎臟等實(shí)體組織必須通過(guò)機(jī)械分離和消化酶處理。目前認(rèn)為應(yīng)根據(jù)不同組織采用不同消化酶進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的處理[6]。腎臟組織的復(fù)雜性使其在單細(xì)胞懸液制備方面存在一定難度，尚缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

此外，樣本處理可能影響細(xì)胞狀態(tài)及基因表達(dá)。研究證實(shí)消化酶會(huì)激活應(yīng)激相關(guān)基因[7]。研究提示低溫酶消(4℃)可有效降低常規(guī)37℃生物酶消對(duì)于細(xì)胞的影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)破壞細(xì)胞膜獲取單個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(snRNA-seq)在腎臟scRNA-seq中具有一定優(yōu)越性[9]。但細(xì)胞RNA中僅10%～20%位于細(xì)胞核內(nèi)，snRNA-seq將丟失細(xì)胞質(zhì)RNA信息[10]。

單細(xì)胞捕獲技術(shù)捕獲單個(gè)細(xì)胞并對(duì)單個(gè)細(xì)胞的RNA進(jìn)行擴(kuò)增是scRNA-seq的特色。單細(xì)胞捕獲方法可以分為孔板與微流控技術(shù)，RNA擴(kuò)增方法可分為指數(shù)擴(kuò)增與線性擴(kuò)增。目前scRNA-seq根據(jù)單細(xì)胞捕獲的方法不同，細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法的不同分為不同方法。下面就幾種經(jīng)典的scRNA-seq方法進(jìn)行介紹。

通過(guò)人工吸取、激光顯微切割和流式細(xì)胞儀分選等方法，研究者可將單個(gè)細(xì)胞捕獲至孔板中，裂解孔板中的單個(gè)細(xì)胞，在獨(dú)立封閉的反應(yīng)孔中進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。

Smart-seq2是一種通過(guò)模板置換擴(kuò)增單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的方法，能夠獲取單個(gè)細(xì)胞1萬(wàn)多個(gè)基因的表達(dá)，此方法被廣泛改良并運(yùn)用于多種scRNA-seq方法中[11]。STRT-seq在Smart-seq2的基礎(chǔ)上引入一段特定序列(單細(xì)胞條形碼 barcode)合并到細(xì)胞cDNA序列中，同一細(xì)胞的cDNA通過(guò)復(fù)制擴(kuò)增出具有相同barcode的序列，實(shí)現(xiàn)將多個(gè)細(xì)胞的cDNA序列進(jìn)行合并處理。STRT-seq豐富了5′端轉(zhuǎn)錄本，使其具有提供轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)信息的優(yōu)勢(shì)[12]。CEL-seq使用包含T7啟動(dòng)子的poly (T)引物實(shí)現(xiàn)cDNA的線性擴(kuò)增，產(chǎn)生更均勻的擴(kuò)增結(jié)果[13]。MARS-seq在poly(T)引物中加入特異分子標(biāo)志(UMIs)并通過(guò)自動(dòng)化流程提高了細(xì)胞數(shù)量[14]。納米級(jí)微孔板將試劑反應(yīng)體積從微升降低到納升，降低成本和實(shí)驗(yàn)不穩(wěn)定性。基于納米孔的Seq-Well可捕獲86 000個(gè)細(xì)胞[15]，單細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞因重力作用自然沉降到納米微孔，在獨(dú)立微孔中進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記與擴(kuò)增。郭國(guó)驥團(tuán)隊(duì)研發(fā)的Microwell-Seq采用類似的技術(shù)原理，采用瓊脂糖制備微孔板，保證穩(wěn)定性的同時(shí)，降低實(shí)驗(yàn)成本。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)此方法首次繪制了小鼠大部分器官與組織的細(xì)胞圖譜[16]。

以集成流體管道(IFCs)和微液滴為代表的微流控系統(tǒng)是另一種單細(xì)胞捕獲技術(shù)。Fluidigm C1是第一個(gè)用于scRNA -seq的微流控系統(tǒng)。單個(gè)細(xì)胞隨著液體進(jìn)入不同孔徑的芯片，固定在芯片的納米級(jí)反應(yīng)空間內(nèi)，通過(guò)改良的Smart-seq方法進(jìn)行擴(kuò)增建庫(kù)。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方案將細(xì)胞量從96個(gè)增至800個(gè)(C1 HT-IFC)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的混合處理[17]。另一類微流控技術(shù)通過(guò)產(chǎn)生大量納米級(jí)微液滴，形成油包水結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞封閉在液滴中，使其具有獨(dú)立的反應(yīng)空間，技術(shù)方式包括Drop-seq[18]和InDrops[19]。Drop-seq中細(xì)胞RNA與附著于磁珠的barcode結(jié)合，在一個(gè)共同的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。而對(duì)于InDrop，barcode與mRNA雜交后直接在液滴中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。研究顯示InDrops能對(duì)50%的上樣細(xì)胞產(chǎn)生測(cè)序數(shù)據(jù)，其成功率是Drop-seq的十倍[10]。10x Genomics公司根據(jù)InDrops進(jìn)行一定修改后開發(fā)出Chromium單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)目前已廣泛應(yīng)用于各類單細(xì)胞研究中[20]。

數(shù)據(jù)處理與分析scRNA-seq數(shù)據(jù)處理與分析的方法與Bulk RNA-seq類似。不同的是單細(xì)胞數(shù)據(jù)涉及將條形碼、UMI數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)拼接對(duì)齊，單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組相似性聚類分析等問(wèn)題。

scRNA-seq數(shù)據(jù)在進(jìn)行分析之前需要良好的質(zhì)量控制，應(yīng)注意排除紅細(xì)胞污染、雙細(xì)胞、細(xì)胞碎片干擾等數(shù)據(jù)。細(xì)胞線粒體RNA含量較高可能表示該細(xì)胞結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞丟失大量細(xì)胞質(zhì)RNA，不能反映細(xì)胞真實(shí)情況[10]。但應(yīng)注意甄別部分能量代謝旺盛的細(xì)胞中線粒體RNA比例較高的情況[21]。

scRNA-seq數(shù)據(jù)分析得到多個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，可通過(guò)細(xì)胞多個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行細(xì)胞聚類。細(xì)胞多基因相似性代表細(xì)胞多維度的相對(duì)關(guān)系。研究者通常采用降維處理的方法，將多維關(guān)系較為真實(shí)地投射到二維或三維體系中，細(xì)胞在二維圖譜中的相互距離表示其在基因水平的差異程度。主成分分析(PCA)和t分布隨機(jī)鄰域嵌入分析(t-SNE)是常用的降維方法[22]。注釋聚類后驅(qū)動(dòng)集群的基因(標(biāo)記基因)，或?qū)υ搧喨杭?xì)胞進(jìn)行功能分析，可反映細(xì)胞亞群的生物意義。此外通過(guò)偽時(shí)間分化分析的方法可模擬多個(gè)亞群細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分化或轉(zhuǎn)變過(guò)程[23]。

機(jī)器學(xué)習(xí)等人工智能領(lǐng)域的快速發(fā)展，使得單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)分析方法不斷豐富，能夠更加全面、準(zhǔn)確地闡釋scRNA-seq數(shù)據(jù)。

正常腎臟細(xì)胞圖譜

隨著scRNA-seq的迅猛發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到scRNA-seq對(duì)于腎臟研究的重要性。本中心首次針對(duì)20個(gè)正常小鼠足細(xì)胞[24]和33個(gè)系膜細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq研究[25]。這是首次對(duì)腎臟固有細(xì)胞基因表達(dá)情況的單細(xì)胞研究。賓夕法尼亞大學(xué)團(tuán)隊(duì)對(duì)7只健康雄性小鼠腎臟進(jìn)行scRNA-seq研究，將43 745個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，確定了16個(gè)不同的細(xì)胞亞群，通過(guò)偽時(shí)間分化軌跡分析和體內(nèi)譜系追蹤發(fā)現(xiàn)了一種處于閏細(xì)胞和主細(xì)胞之間的新的細(xì)胞亞群。研究還證明了Notch通路的激活可驅(qū)動(dòng)閏細(xì)胞向主細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。這項(xiàng)工作首次描繪了正常成年小鼠腎臟細(xì)胞的完整基因表達(dá)圖譜，并且展現(xiàn)出成熟腎臟驚人的分化靈活性[21]。另一團(tuán)隊(duì)通過(guò)癌旁正常腎組織捕獲了37 951個(gè)正常人腎臟非免疫細(xì)胞和4 796個(gè)正常腎臟免疫細(xì)胞，繪制了人的正常腎臟細(xì)胞圖譜[26]。腎臟scRNA-seq研究使人們對(duì)于腎臟細(xì)胞的認(rèn)識(shí)與分類從形態(tài)學(xué)逐漸發(fā)展到分子水平。

目前在正常腎臟scRNA-seq數(shù)據(jù)中，以近端腎小管上皮細(xì)胞為主[27]。之前根據(jù)腎臟不同解剖分區(qū)的研究已經(jīng)證明了區(qū)域研究能夠有助于對(duì)腎小球的認(rèn)識(shí)[4]。研究者針對(duì)正常小鼠腎小球進(jìn)行scRNA-seq，在每個(gè)細(xì)胞平均630個(gè)基因的測(cè)序深度上，得到近13 000個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出五種腎小球亞群：足細(xì)胞(80%)、系膜細(xì)胞(2%)和內(nèi)皮細(xì)胞(12%)、小管細(xì)胞(6%)和免疫細(xì)胞(0.2%)[28]。盡管這樣的細(xì)胞種類構(gòu)成可能受到組織消化等因素影響，但研究仍發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中有一群增殖相關(guān)的亞群，足細(xì)胞亞群更為均勻，可大致分為三個(gè)以前未知的亞群。

由于缺乏跨物種相似細(xì)胞群的共同標(biāo)記，使得從動(dòng)物模型向人類腎臟研究的轉(zhuǎn)化較為困難。阿拉巴馬大學(xué)團(tuán)隊(duì)通過(guò)分選小鼠、大鼠、豬和人的腎臟免疫細(xì)胞后進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)CD74和CD81為腎臟巨噬細(xì)胞跨物種的標(biāo)志物[29]。該研究豐富了針對(duì)腎臟定居免疫細(xì)胞的研究方式，也為多物種腎臟研究及臨床轉(zhuǎn)化提供了新的研究思路。

腎臟疾病的scRNA-seq研究

通過(guò)scRNA-seq研究，人們希望了解腎臟細(xì)胞在疾病過(guò)程中的病理改變過(guò)程，更加精細(xì)地展現(xiàn)腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制，并為精準(zhǔn)靶向逆轉(zhuǎn)和改善疾病發(fā)展過(guò)程提供可能的方向(圖1)。

圖1 腎臟疾病單細(xì)胞RNA測(cè)序研究示意圖

本中心合作開展了針對(duì)糖尿病腎損害小鼠(DKD)腎小球的scRNA-seq研究，DKD腎小球可分為五種細(xì)胞群，包括腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、免疫細(xì)胞和部分腎小管細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)DKD腎小球的免疫細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常腎小球，而這些免疫細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主。通過(guò)與對(duì)照組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞比較發(fā)現(xiàn)，DKD的內(nèi)皮細(xì)胞中血管生成和遷移通路的基因和系膜細(xì)胞中調(diào)控基因翻譯、表達(dá)及蛋白穩(wěn)定的基因均發(fā)生改變，并在Bulk RNA-seq中得到證實(shí)[30]。

Der等[31]對(duì)狼瘡性腎炎(LN)患者的皮膚、腎活檢樣本及外周血進(jìn)行了scRNA-seq研究。該研究發(fā)現(xiàn)一種以干擾素反應(yīng)相關(guān)的基因與LN嚴(yán)重程度有關(guān)。LN患者的皮膚樣本表現(xiàn)出該基因的類似特征，表明這種更易獲取的組織樣本一定程度上可以反映LN患者的疾病狀態(tài)。

從小鼠腎臟scRNA-seq的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，人類單基因遺傳疾病中表現(xiàn)為蛋白尿的有21個(gè)基因在小鼠中只表達(dá)于一類細(xì)胞——腎小球足細(xì)胞[21]。盡管有研究認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞和近端小管在蛋白尿的形成過(guò)程中存在一定關(guān)系，但本研究表明足細(xì)胞功能障礙是蛋白尿發(fā)生的主要原因。該研究還發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致腎小管酸中毒的基因只表達(dá)于小鼠集合管閏細(xì)胞，證明了該細(xì)胞在酸堿平衡中的重要作用。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)血壓、慢性腎臟病、血清代謝物水平和腎結(jié)石相關(guān)的疾病基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疾病相關(guān)基因只在單個(gè)細(xì)胞類型中表達(dá)。該研究通過(guò)scRNA-seq發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致腎臟疾病的基因主要位于一種特定類型的細(xì)胞，這提示腎臟某一細(xì)胞種類的病理改變可直接導(dǎo)致特定疾病的發(fā)生[21]。

針對(duì)以混合排斥反應(yīng)為主的移植腎scRNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，移植腎單核細(xì)胞的浸潤(rùn)在排斥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與正常對(duì)照相比，有兩群?jiǎn)魏思?xì)胞在正常腎臟中表達(dá)較少，而在移植腎混合排斥反應(yīng)表達(dá)增加。一群表達(dá)FCGR3A (CD16)的單核細(xì)胞與CD16陽(yáng)性、促炎、非典型單核細(xì)胞相似，另一群則類似經(jīng)典或中間態(tài)單核細(xì)胞。該研究進(jìn)一步對(duì)成人腎臟進(jìn)行snRNA-seq，在4 259個(gè)單細(xì)胞核數(shù)據(jù)中確定了6種不同的上皮細(xì)胞亞群，包括足細(xì)胞、近端小管、主細(xì)胞和閏細(xì)胞等。通過(guò)整合scRNA-seq與snRNA-seq數(shù)據(jù)，將排斥反應(yīng)與正常對(duì)照組織對(duì)比，發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)并未從根本上改變腎小管細(xì)胞的特性。此外還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分為三個(gè)不同的亞群:靜止細(xì)胞亞群和兩種活化的內(nèi)皮細(xì)胞群。其中，一種活化的內(nèi)皮細(xì)胞亞群表達(dá)Fc受體通路激活的基因，與抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)的病理診斷結(jié)果一致[32]。

scRNA-seq研究還涉及腎臟腫瘤中異質(zhì)性明顯的腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)移性透明細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(gefitinib、erlotinib和afatinib)、SRC家族激酶(dasatinib)和BRAF-MEK (selumetinib)的藥物敏感，而原發(fā)腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向MET的藥物(tivantinib、foretinib和crizotinib)和磷酸肌醇激酶(BKM120)更敏感，證明利用scRNA- seq研究可以為患者提供更加合理的個(gè)體化診療方案[33]。一項(xiàng)來(lái)自人類腎臟腫瘤、正常胚胎，兒童和成人腎臟的scRNA-seq研究，證明Wilms腫瘤細(xì)胞來(lái)源于異常胚胎細(xì)胞，揭示了人類腎臟腫瘤的精確細(xì)胞特征和組成，為未來(lái)腎臟腫瘤研究提供了方向[26]。一項(xiàng)對(duì)73例腎透明細(xì)胞癌患者和5例健康對(duì)照者的研究，在350萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中確定了17個(gè)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群，22個(gè)T細(xì)胞亞群，以及一個(gè)與腫瘤無(wú)進(jìn)展相關(guān)的獨(dú)特免疫細(xì)胞組成，展現(xiàn)了腎臟腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞圖譜，揭示了免疫治療的潛在生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)[34]。

scRNA-seq在腎臟應(yīng)用的挑戰(zhàn)與展望

腎臟細(xì)胞中上皮細(xì)胞眾多，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如何從腎臟復(fù)雜環(huán)境中獲取狀態(tài)良好的單個(gè)細(xì)胞是目前腎臟scRNA-seq研究所面臨的一個(gè)難題。普遍認(rèn)為單個(gè)細(xì)胞表達(dá)的基因數(shù)應(yīng)在5 000～20 000，而目前大部分高通量scRNA-seq方法很難實(shí)現(xiàn)如此高的基因捕獲率，致使部分轉(zhuǎn)錄信息被遺漏。低覆蓋的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可能直接導(dǎo)致錯(cuò)誤的細(xì)胞聚類，從根本上削弱scRNA-seq的研究意義。雖然存在單細(xì)胞制備困難、微量RNA擴(kuò)增偏倚等情況，但是迅猛發(fā)展的scRNA-seq研究已經(jīng)在肝臟、腦、脾、肺、胎盤等組織器官中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了令人矚目的結(jié)果。

隨著scRNA-seq研究的發(fā)展與革新，單細(xì)胞基因組學(xué)、單細(xì)胞表觀遺傳組學(xué)、單細(xì)胞蛋白組學(xué)及單細(xì)胞空間組學(xué)也逐漸發(fā)展與豐富[20]。其中單細(xì)胞空間組學(xué)能夠?qū)η衅M織進(jìn)行原位RNA水平或蛋白質(zhì)水平的定量分析，這可能極大改變目前對(duì)于腎活檢組織的評(píng)價(jià)方式[35]。通過(guò)整合單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)，我們可以在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)疾病過(guò)程進(jìn)行全面了解。我們有理由相信scRNA-seq所帶動(dòng)發(fā)展的單細(xì)胞多組學(xué)研究能夠極大提升目前對(duì)于腎臟的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)實(shí)現(xiàn)腎臟領(lǐng)域精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)程。