安宮牛黃丸對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注MMP9、AQP4表達(dá)的影響

李繼中，江 艷，曾 艷，顏小庚，顏俊文

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 珠海 519100；3.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院 新生兒科， 廣東 珠海 519100)；4.遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

腦卒中已經(jīng)成為我國(guó)疾病譜中第一大死亡原因，而缺血性腦血管病變占腦卒中的絕大部分(70%～80%)。血液中的各種栓子(如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、心臟內(nèi)的附壁血栓、脂肪栓子等)隨血液進(jìn)入腦動(dòng)脈而導(dǎo)致腦內(nèi)的血管出現(xiàn)部分或完全阻塞，當(dāng)側(cè)支循環(huán)不能代償時(shí)，引起該動(dòng)脈供血區(qū)腦組織缺血性壞死，出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損，如肢體偏癱、言語(yǔ)障礙、吞咽困難等。具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特征，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。安宮牛黃丸是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥精品，具有清熱解毒、鎮(zhèn)驚開竅等功效。主要用于神昏譫語(yǔ)，中風(fēng)昏迷及腦炎、腦出血等疾病[1]，其治療機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討安宮牛黃丸對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠腦保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康清潔級(jí)SD大鼠50只，平均體重(230±20)g，購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境(光照12 h/黑夜12 h，濕度50%左右，溫度24 ℃左右)。

1.2 藥品和試劑 安宮牛黃丸購(gòu)自北京同仁堂公司；MCAO栓線購(gòu)自北京沙東生物公司，紅四氮唑(分析純)購(gòu)自上海山浦化工有限公司。

1.3 儀器 電子分析天平：北京賽多利斯電子天平有限公司；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)：Millipore Trading Co.ltd；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 50只SD大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組(假手術(shù)+給予1 mL蒸餾水)、模型組(造模+給予1mL蒸餾水)、安宮牛黃丸低劑量組(造模+給予安宮牛黃丸1.0 g/kg)、安宮牛黃丸中劑量組(造模+給予安宮牛黃丸2.0 g/kg)、安宮牛黃丸高劑量組(造模+給予安宮牛黃丸3.0 g/kg)；連續(xù)灌胃給藥4 d后手術(shù)制作腦缺血再灌注動(dòng)物模型，造模成功后連續(xù)予以灌胃給藥2 d。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作 SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)麻醉，隨后將麻醉好的大鼠固定在木板上，用碘伏消毒手術(shù)周圍皮膚，用手術(shù)刀在頸前中間稍偏右切開皮膚，改用止血鉗繼續(xù)往下鈍性分離皮下組織，肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，繼續(xù)向遠(yuǎn)心端分離，顯露頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉部，在動(dòng)總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈下放置絲線，將頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈分別結(jié)扎，使用動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉，用小眼科剪刀在頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈之間剪開一個(gè)小口，從小切口往里緩慢插入MACO線，阻斷大腦中動(dòng)脈(長(zhǎng)度為：以頸內(nèi)動(dòng)脈和外動(dòng)脈的交叉處作為標(biāo)志，往遠(yuǎn)心端插入約2.0 cm)，阻斷1 h后將MACO往外拔出約1 cm并剪斷，將大鼠放回鼠籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6 神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠手術(shù)后48 h, 根據(jù)其行為及癱瘓情況進(jìn)行評(píng)分(評(píng)分方法參照文獻(xiàn)1)，共分為6 個(gè)等級(jí)(0～5分)。0：大鼠完全正常；1：左前肢不能完全伸直；2：左前肢行走偏向左側(cè); 3：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)行走;4：原地左旋; 5：左側(cè)肢體不能活動(dòng)。

1.7 測(cè)定腦梗死體積 手術(shù)后48 h相繼斷頸法處死大鼠，立即剝離出完整大腦，放入-20℃冰柜冰凍約18 min，將冰凍過的大腦取出后用薄刀片冠狀平均切成5張薄片，每片厚度約3 mm，輕輕放入玻璃平皿中(玻璃平皿事先盛有1%TTC溶液)，隨后放置烤箱中37℃孵育約30 min(每隔5分鐘翻轉(zhuǎn)一次)，梗死區(qū)呈白色，非梗死區(qū)被染成鮮紅色。染色穩(wěn)定后，倒掉TTC溶液，用生理鹽水漂洗2次，棄去，加入10%甲醛溶液，固定24 h后照相，利用多田公式[體積=π/6×長(zhǎng)(cm)×寬(cm)×高(cm)]計(jì)算腦梗死體積。

1.8 腦組織含水量 處死大鼠后取大腦，置于電子分析天平上稱濕重，隨后放在玻璃瓶中，置烤箱中烘干至恒重，電子分析天平上稱干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.9 RT-PCR測(cè)定腦組織MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表達(dá) 取梗死區(qū)域腦組織50 mg左右加1.0 mL trizol液，參照trizol說(shuō)明書提取RNA，純化并測(cè)定濃度合格后逆轉(zhuǎn)錄，隨后加樣置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AQP4 的 正 向 引 物 序 列 為 5’-GTGCTAGGAAACTGATATG-3’，反向引物序列為 5’-TCTGGTGTAGTACATTCAA-3’。MMP9 的 正 向 引 物 序 列 為 5’-CAATCCTTGCAATGTGGATG-3’，反向引物序列為 5’-CAATACCGACCGTCCTTGAA -3’。反應(yīng)條件(預(yù)變性95 ℃10 min ,50 ℃ 2 min ；PCR反應(yīng)95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min 40 Cycles)，采用2ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 安宮牛黃丸可以降低神經(jīng)功能評(píng)分 與假手術(shù)組相比較，模型組的評(píng)分增高明顯(P<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作成功；與模型組相比較，安宮牛黃丸各組均降低神經(jīng)功能評(píng)分(P<0.05)，與模型組比較，低、中、高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明安宮牛黃丸對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用(見表1)。

組別神經(jīng)功能評(píng)分假手術(shù) 0模型 4.5±1.2#安宮牛黃丸低劑量 2.8±1.0?安宮牛黃丸中劑量 2.4±1.1?安宮牛黃丸高劑量 2.6±1.3?

#：與假手術(shù)組比較,P<0.05;*：與模型組比較,P<0.05。

2.2 安宮牛黃丸可以減少腦梗死體積 各組大鼠腦梗死切片情況見圖1。與假手術(shù)組相比較，模型組梗死體積較大(P<0.05)，表明模型成功；與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減少腦梗死體積(P<0.05)，表明安宮牛黃丸對(duì)腦缺血再灌注損傷均有保護(hù)作用，以中劑量組效果更佳(見表2)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：安宮牛黃丸低劑量組；D：安宮牛黃丸中劑量組；E：安宮牛黃丸高劑量組。圖1 1%TTC 染色后的大鼠腦組織切片

組別腦梗死體積(cm3)假手術(shù) 0模型 0.130±0.016#安宮牛黃丸低劑量 0.080±0.014?安宮牛黃丸中劑量 0.076±0.018?安宮牛黃丸高劑量 0.079±0.020?

#：與假手術(shù)組比較,P<0.05;*：與模型組比較,P<0.05。

2.3 安宮牛黃丸可以減輕梗死周圍腦水腫 從表3結(jié)果可以看出，大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫情況中，與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減輕腦水腫(P<0.05)，減輕腦水腫效果：中劑量組>高劑量組>低劑量組。

組別腦組織含水量(%)假手術(shù) 0模型 84±1.21#安宮牛黃丸低劑量 78±1.30?安宮牛黃丸中劑量 76±0.98?安宮牛黃丸高劑量 77±0.87?

#：與假手術(shù)組比較,P<0.05；*：與模型組比較,P<0.05。

2.4 梗死區(qū)腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(dá) 各組大鼠腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(dá)情況見表4。與假手術(shù)組相比較，模型組MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(dá)量較高(P<0.05)，表明模型成功；與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減少腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，表明安宮牛黃丸對(duì)腦缺血再灌注損傷均有保護(hù)作用(見表4)。

組別MMP9 mRNAAQP4 mRNA假手術(shù) 0.05±0.010.65±0.11模型 0.18±0.02#1.52±0.23#安宮牛黃丸低劑量 0.12±0.02?0.93±0.18?安宮牛黃丸中劑量 0.08±0.01?0.85±0.15?安宮牛黃丸高劑量 0.09±0.01?0.89±0.20?

#：與假手術(shù)組比較P<0.05； *：與模型組比較,P<0.05。

3 討論

腦梗死治療關(guān)鍵是盡快恢復(fù)血供，方法有靜脈溶栓或介入治療等，而據(jù)大樣本臨床觀察，血管再通后很大一部分患者并沒有因此而得到更好的恢復(fù)，主要原因就是缺血再灌注使腦組織損傷進(jìn)一步加重，如何降低腦缺血再灌注損傷成為目前亟待解決的問題。

血腦屏障(Blood brain barrier ，BBB)的完整性有效的保護(hù)了腦組織免受破壞，而在缺血缺氧情況下，BBB遭到破壞，導(dǎo)致早期出現(xiàn)細(xì)胞毒性腦水腫，隨后出現(xiàn)輕度血管源性腦水腫，進(jìn)而加重腦梗死患者的病情，從而加速患者死亡[2]，MMP9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員中最重要的一員，參與了BBB破壞過程，在缺血缺氧和炎癥刺激下，MMP9被大量分泌和激活，直接降解BBB的神經(jīng)血管基底層和緊密連接蛋白，導(dǎo)致BBB破壞[3-5]；與此同時(shí)，AQP4作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的選擇性水通道蛋白，參與了腦水腫的發(fā)展和消退，當(dāng)AQP4表達(dá)上調(diào)時(shí)，可引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫，進(jìn)而使BBB 遭到破壞，導(dǎo)致腦水腫[6-9]。當(dāng)BBB破壞后，腦組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間隙水腫，腦組織水分進(jìn)一步增加，從而使神經(jīng)元壞死[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中，SD大鼠腦缺血1 h再灌注48 h后，MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(dá)顯著增高，激活了BBB的破壞過程，安宮牛黃丸治療組中，腦梗死體積明顯降低、神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善、腦水腫程度也較模型組減輕，可能與安宮牛黃丸降低MMP9及AQP4 有關(guān)。

安宮牛黃丸對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與其抑制MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表達(dá)有關(guān)。