劍麻感染煙草疫霉菌后幾種重要防御酶活性的變化

鄭金龍，易克賢*，習(xí)金根，黃興，吳偉懷，高建明，張世清，陳河龍，賀春萍*，粱艷瓊，陸英

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所／農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所／農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101）

劍麻是我國(guó)熱區(qū)乃至全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物［1］，其不僅是主要的熱帶纖維原料［2］，同時(shí)也是一種重要的生物質(zhì)能源植物［3］。我國(guó)劍麻產(chǎn)業(yè)面臨良好發(fā)展機(jī)遇的同時(shí)，也面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。40多年來，我國(guó)種植劍麻的主栽品種為從國(guó)外引進(jìn)的雜交種H.11648，此品種雖然高產(chǎn)，但易感斑馬紋病。斑馬紋病是當(dāng)前劍麻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的毀滅性病害之一，其病原菌主要為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianaevan Breda de Haan）［4-6］。目前，防治該病的主要措施是使用殺菌劑和種植抗病品種。但由于該病潛伏期長(zhǎng)、致病機(jī)理不明以及劍麻植株的蠟質(zhì)層、鱗片極大地阻礙了藥劑的順利滲入等原因，導(dǎo)致殺菌劑的防治效果差；同時(shí)由于劍麻是多年生植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)十年以上，抗原十分有限，給抗病育種帶來了很大困難。

植物受到病原物侵染而發(fā)生主動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)一系列防御酶系會(huì)發(fā)生某些變化［7］，它們相互協(xié)同發(fā)揮作用，不同植物甚至同種植物的不同品種、不同脅迫因子等條件下酶活性的變化與抗病性也不相同，甚至相反［8］。近年來，學(xué)者們對(duì)防御酶活性變化與植物抗病性的關(guān)系進(jìn)行了廣泛的研究。魏穎穎［9］對(duì)煙草接種CMV前后CAT活性與抗病性的關(guān)系進(jìn)行了研究。陳利鋒等［10］利用禾谷鐮孢菌接種不同抗赤霉病的小麥品種，比較了接種后不同時(shí)間穗組織中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活力變化。邵登魁等［11］研究了白菜型冬油菜在感白粉病品種全生育期和全病程中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）的活性變化。而關(guān)于劍麻防御酶活性的研究，目前僅有少數(shù)幾篇報(bào)道［12-15］。本文以劍麻易感病品種H.11648為材料，在接種煙草疫霉菌前后，分別測(cè)定劍麻葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶 （PPO）、過氧化氫酶 （CAT）、過氧化物酶 （POD）、幾丁質(zhì)酶（CHT）、＆-1，3葡聚糖酶（GLU）等7種酶的活性，以了解劍麻感染煙草疫霉前后幾種重要防御酶活性的變化，并分析病菌對(duì)劍麻生理反應(yīng)的影響，旨在為進(jìn)一步研究煙草疫霉菌與劍麻之間的互作機(jī)理奠定生理生化基礎(chǔ)，這對(duì)高效選育抗病品種和持久利用劍麻的抗病性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

劍麻（H.11648）盆栽苗，株高50 cm；煙草疫霉菌強(qiáng)致病力菌株CH0008由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定和保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種前酶活性測(cè)定

取14株生長(zhǎng)基本一致的盆栽苗，其中7株作為對(duì)照，7株作為處理組，每個(gè)處理3次重復(fù)。從最下部開始，每株各割取一片完好的葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈、晾干后，及時(shí)測(cè)定其PAL、SOD、PPO、CAT、POD、CHT和GLU等7種酶活性，酶活性測(cè)定方法均按照酶活試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）步驟測(cè)定。

1.2.2 菌株的制備及接種

將保存的煙草疫霉菌用PDA培養(yǎng)基活化，置于28℃生化培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7 d，以備接種，從麻苗最下部的葉片開始選擇完好葉片全部接種，接種位置距葉片基部10 cm，接種時(shí)先用75%酒精消毒，刺傷表皮組織，將直徑6mm的菌塊帶菌絲一面貼于傷口處（對(duì)照的3株，將同樣大小的空白 PDA貼于傷口處），用棉花保濕，置于28℃環(huán)境條件下培養(yǎng)［14］。

1.2.3 接種后酶活性測(cè)定

分別于接種后24、48、72、96、120 h取劍麻幼葉提取粗酶液。檢測(cè)不同時(shí)間劍麻體內(nèi)相關(guān)防御酶的活性變化。葉片取樣及酶活性測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用JMP10軟件進(jìn)行方差分析，并用杜凱氏差距（Tukey HSD）檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

由圖1可知，接種煙草疫霉菌后各個(gè)時(shí)間段的PAL活性均比對(duì)照（CK）高，說明煙草疫霉菌可以誘導(dǎo)劍麻葉片PAL活性增強(qiáng)。對(duì)照組劍麻葉片PAL活性在0～120 h之間沒有明顯變化。接種煙草疫霉菌的劍麻葉片，PAL活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移先呈逐步上升的趨勢(shì)，96 h時(shí)達(dá)到峰值78.888 U／g，隨后隨著時(shí)間的推移呈逐步下降的趨勢(shì)。

圖1 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片PAL活性變化Fig.1 Changes of PAL activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

2.2 對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

如圖2所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，SOD活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移先呈下降的趨勢(shì)，48 h時(shí)降到最低值50.959 U／g，且低于CK，說明劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染前期SOD活性受到抑制；隨后隨著時(shí)間的推移而逐步上升，120 h時(shí)達(dá)到最高值88.013 U／g。對(duì)照組的劍麻葉片，SOD活性在0～120 h之間沒有顯著性變化。

2.3 對(duì)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

如圖3所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，PPO活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，96 h時(shí)達(dá)到最高值156.801 U／g，隨后隨著時(shí)間的推移而逐步下降，且48～120 h之間，處理組PPO活性顯著高于CK，說明煙草疫霉菌可以誘導(dǎo)劍麻葉片PPO活性增強(qiáng)。對(duì)照組的PPO活性隨著時(shí)間的推移沒有顯著性變化。

2.4 對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響

如圖4所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，CAT活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，48 h時(shí)達(dá)到最高值1267.863 U／g，隨后隨著時(shí)間的推移而逐步下降，72 h時(shí)達(dá)到最低值0.259 U／g，隨后沒有顯著性變化，說明煙草疫霉菌在侵染前期先誘導(dǎo)劍麻葉片CAT活性增強(qiáng)，隨后又抑制了其酶活性。對(duì)照組的CAT活性隨著時(shí)間的推移基本保持不變。

圖2 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片SOD活性變化Fig.2 Changes of SOD activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

圖3 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片PPO活性變化Fig.3 Changes of PPO activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

圖4 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片CAT活性變化Fig.4 Changes of CAT activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

2.5 對(duì)過氧化物酶（POD）活性的影響

如圖5所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，在0～120 h之間，處理組各個(gè)時(shí)間段的POD活性均比CK高，說明煙草疫霉菌可以誘導(dǎo)劍麻葉片POD活性增強(qiáng)。POD活性隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，96 h時(shí)達(dá)到峰值1854.583 U／g，隨后隨著時(shí)間的推移而逐步下降。對(duì)照組的POD活性隨著時(shí)間的推移沒有顯著性變化。

圖5 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片POD活性變化Fig.5 Changes of POD activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

2.6 對(duì)幾丁質(zhì)酶（CHT）活性的影響

如圖6所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，CHT活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而CK的CHT活性隨著時(shí)間的推移沒有顯著性變化。其中，24～72 h期間，處理組CHT活性均低于CK，96 h以后處理組CHT活性高于CK，且120 h時(shí)達(dá)到顯著差異。

圖6 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片CHT活性變化Fig.6 Changes of CHT activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

2.7 對(duì)＆-1，3葡聚糖酶（GLU）活性的影響

如圖7所示，劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，GLU活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而CK的GLU活性隨著時(shí)間的推移沒有顯著性變化。24～48 h期間，處理組GLU活性低于CK，其中24 h時(shí)呈顯著性差異；72～120 h期間，處理組GLU活性顯著高于CK。

3 討論

劍麻葉片在用針刺傷后，噴無(wú)菌水，不接種煙草疫霉菌，其PAL、SOD、PPO、CAT、POD、CHT和GLU等7種酶活性在0～120 h期間沒有顯著性變化，說明針刺對(duì)劍麻表皮造成的微小傷口不足以對(duì)劍麻內(nèi)部的生理生化等新陳代謝產(chǎn)生影響，因此，對(duì)葉片中酶活性的影響也較小。這與趙艷龍等［14］的研究結(jié)果相一致。

圖7 接種煙草疫霉菌前后劍麻葉片GLU活性變化Fig.7 Changes of GLU activity in sisal leaves before and after inoculation with Phytophthora nicotianae

在本研究中，劍麻受煙草疫霉菌侵染后，PAL、PPO、CAT和POD的活性在0～120 h期間均高于對(duì)照，且隨著時(shí)間的推移均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的防御酶活性提高可增強(qiáng)植物抵抗包括病害在內(nèi)逆境的能力這一論點(diǎn)相一致［16-18］。說明在煙草疫霉菌侵染的劍麻葉片中PAL、PPO、CAT和POD等酶活性的增加與寄主抵抗病原入侵有一定的相關(guān)性，可以將其活性作為植物抗病的一個(gè)生理指標(biāo)。但與趙艷龍等［14］的研究結(jié)果不盡相同，這可能與取樣的時(shí)間、劍麻植株種植區(qū)域、病原菌的來源及致病力大小等有關(guān)，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

劍麻葉片受煙草疫霉菌侵染后，SOD活性在0～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與朱友林等［19］的研究結(jié)果相一致，說明病原菌侵染初期，SOD活性下降與抗病系細(xì)胞質(zhì)膜透性迅速增加、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較早變化、細(xì)胞過敏性壞死以及DIMBOA迅速大量釋放等早期抗病性反應(yīng)有密切關(guān)系，而病原菌侵染中、后期SOD活性較大幅度上升，與抗病系在病程中、后期限制病斑擴(kuò)展的能力有關(guān)。

GLU和CHT作為在植物保衛(wèi)反應(yīng)中起主要作用的細(xì)胞壁水解酶，受到許多學(xué)者的關(guān)注［20］。左豫虎等［21］的研究表明，大豆疫霉菌能誘導(dǎo)大豆GLU和CHT的活性增強(qiáng)，但2種酶在積累速度和幅度上，抗病品種和感病品種有顯著的差異。史娟等［22］的研究表明，葡萄霜霉病菌能誘導(dǎo)葡萄葉片GLU和CHT活性增高，且兩種酶活性增高的速度和幅度與品種的抗病性呈正相關(guān)。在本研究中，接種煙草疫霉菌的劍麻葉片，GLU和CHT酶活性在24～120 h之間隨著時(shí)間的推移呈逐步上升的趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果相一致［21-22］，說明劍麻煙草疫霉菌能誘導(dǎo)劍麻葉片組織GLU和CHT的活性增強(qiáng)，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了GLU和CHT在植物抗病中的重要作用。

本文以高感品種H.11648為研究材料，對(duì)接種病原菌前后幾種防御酶的活性變化作了初步探討。接種病原菌后，劍麻葉片中PAL、SOD、PPO、CAT、POD、CHT和GLU等7種酶活性均發(fā)生了變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了植物和病原菌相互作用中，植物體內(nèi)防御酶活性發(fā)生變化是寄主的一種普遍性反應(yīng)，和植物抗病性有一定的關(guān)系這一論點(diǎn)［23］，這為研究酶活性與劍麻抗病性的關(guān)系奠定了一定基礎(chǔ)，同時(shí)也為從分子水平上認(rèn)識(shí)寄主植物與病原菌相互作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。而有關(guān)病原菌侵染后各防御酶表達(dá)的分子機(jī)制以及是否可以將該類酶作為篩選抗性材料的生化指標(biāo)，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)和研究。