C 反應(yīng)蛋白基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥易感性及嚴(yán)重程度的關(guān)系

唐玉霞 單國(guó)勇 狄君斐

膿毒癥是一種由感染引起的危及生命的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征[1]。炎癥反應(yīng)的程度與膿毒癥的預(yù)后密切相關(guān)。C 反應(yīng)蛋白（CRP）是膿毒癥的重要生物標(biāo)志物，可反映炎癥反應(yīng)和敗血癥的嚴(yán)重程度[2-3]。CRP基因的遺傳變異在血管損傷中發(fā)揮作用，而血管損傷可能是膿毒癥引起的微血管功能障礙的基礎(chǔ)[4-5]。然而，CRP 基因多態(tài)性與膿毒癥易感性和嚴(yán)重程度的相關(guān)性尚不明確。基于此，本研究探討CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)與膿毒癥的易感性和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年8 月期間浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普內(nèi)科收治的125例膿毒癥患者作為研究組，年齡23～75 歲，其中一般膿毒癥患者72 例，急性生理與慢性健康評(píng)估II（APACH II）（16.54±4.47）分；嚴(yán)重膿毒癥患者53例，APACH II（22.35±5.12）分。根據(jù)研究組患者的年齡、性別等匹配招募同期健康體檢者125 名作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2001 年美國(guó)危重病醫(yī)學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)制定的膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（2）年齡≥18 歲；（3）臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18 歲；（2）孕婦或處于哺乳期的婦女；（3）嚴(yán)重的臟器功能異常；（4）患免疫系統(tǒng)疾?。唬?）腫瘤患者。

1.3 基因分型 所有受試者均抽取4mL 靜脈血，其中2mL 采用EDTA 抗凝后使用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組提取試劑盒（DP318，規(guī)格：50次）提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱。利用Primer 5.0 軟件根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)SNP 位點(diǎn)序列信息設(shè)計(jì)引物，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。rs1205位點(diǎn)的引物序列為上游：5′-AGGGGACTCTTGGACAGGTT-3′，下游：5′-TTATGGACTTTGGGAGTGAGAC-3′；rs3093062 位點(diǎn)的序列為上游：5′-CAAACTCTATGATTTGGGCTGAAGT-3′，下游：5′-ACGAGTGGCCATCTGGGTG-3′。PCR 擴(kuò)增體系為20μL，模板基因組DNA 25ng，10×PCR buffer 2μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，10μmol/L dNTP 1μL，10pmol/L 的上、下游引物各1μL，0.25μL DNA 聚合酶，用無(wú)菌水補(bǔ)足至20μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃，5min；94℃，20s；60℃，30s；72℃，30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃，5min；4℃保存。PCR 完成后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化，然后將純化產(chǎn)物送上海生工生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.4 血清CRP 蛋白水平檢測(cè) 將剩余的2mL 全血3000r/min 離心20min，取上清，保存于-70℃冰箱。血清CRP 檢測(cè)試劑盒采用abcam 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號(hào)ab99995，批號(hào)201403021）檢測(cè)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)?；蛐头植际欠穹螲ardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析等位基因和基因型頻率的差異，并估計(jì)比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

表1 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率[例（%）]

2.1 兩組一般資料比較 研究組男81 例，女44 例，平均年齡（56.50±10.85）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）（23.42±2.73）kg/m2，有吸煙史56 例，有飲酒史75 例。對(duì)照組男78 例，女47 例，平均年齡（57.10±11.55）歲，BMI（23.67±2.08）kg/m2，有吸煙史52 例，有飲酒史81 例。研究組和對(duì)照組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 CRP 基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與膿毒癥易感性 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。CRP基因rs1205 位點(diǎn)基因型頻率在研究組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.64，P=0.04），該位點(diǎn)TT 基因型是膿毒癥的危險(xiǎn)因素（OR=3.02，95%CI=1.18～7.87，P=0.01），研究組rs1205 位點(diǎn)T 等位基因頻率顯著高于對(duì)照組（χ2=5.05，P=0.03），該位點(diǎn)T 等位基因是膿毒癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR=1.53，95%CI=1.04-2.25，P=0.03）。研究組和對(duì)照組CRP 基因rs3093062位點(diǎn)不同基因型頻率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.30，P＜0.01），GA 和AA 基因型是膿毒癥的危險(xiǎn)因素（OR=2.68，95%CI=1.19～4.83，P＜0.01；OR=4.18，95%CI=1.59～11.29，P＜0.01），研究組rs3093062 位點(diǎn)A 等位基因頻率顯著高于對(duì)照組（χ2=19.51，P＜0.01），該位點(diǎn)A 等位基因是膿毒癥的危險(xiǎn)因素（OR=2.43，95%CI=1.60～3.70，P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 CRP 基因多態(tài)性與性別、年齡的相關(guān)性 本研究中不同性別、年齡受試者CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2-3。

2.4 CRP 基因多態(tài)性與膿毒癥嚴(yán)重程度相關(guān)性不同嚴(yán)重程度膿毒癥患者CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型頻率之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CRP 基因rs1205 位點(diǎn)TT 基因型患者的膿毒癥較為嚴(yán)重，CRP 基因rs3093062 位點(diǎn)AA 基因型患者膿毒癥較為嚴(yán)重，見(jiàn)表4。

表2 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型與性別的相關(guān)性[例（%）]

表3 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型與年齡的相關(guān)性[例（%）]

表4 CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)基因型與膿毒癥嚴(yán)重程度相關(guān)性[例（%）]

2.5 CRP 基因多態(tài)性與血清CRP 水平的相關(guān)性檢測(cè)受試者血清CRP 蛋白水平，結(jié)果顯示，研究組患者血清CRP 水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [（75.46±23.54）mg/μL 比（5.24±1.17）mg/μL，t=33.31，P ＜0.01]。比 較CRP 基 因rs1205 位 點(diǎn) 和rs3093062 位點(diǎn)不同基因型受試者血清CRP 水平結(jié)果顯示，CRP 基因rs1205 位點(diǎn)CC 基因型受試者血清CRP 水平最低，其次是CT 基因型，TT 基因型受試者最高[（24.53±9.17）mg/μL、（35.75±12.15）mg/μL、（71.24 ±18.45）mg/μL，F(xiàn)=65.34，P ＜0.01]。CRP 基 因rs3093062 位點(diǎn)GG 基因型受試者血清CRP 水平最低，其次是GA 基因型、AA 基因型最高 [（31.45±15.42）mg/μL、（47.98±13.54）mg/μL、（66.97±17.42）mg/μL，F(xiàn)=59.64，P＜0.01]。

3 討論

CRP 是由肝細(xì)胞產(chǎn)生的急性期蛋白，CRP 蛋白水平與炎癥反應(yīng)、癌癥、心臟病和糖尿病有關(guān)[7-9]。CRP 基因rs1205 位點(diǎn)SNP 位于CRP 基因的3’UTR區(qū)域，與許多疾病有關(guān)，包括牛皮癬、結(jié)腸直腸癌和糖尿病等[10-12]。rs3093062 位點(diǎn)SNP 位于CRP 基因的啟動(dòng)子區(qū)域，有研究顯示，rs3093062 位點(diǎn)基因多態(tài)性與血漿CRP 水平有顯著相關(guān)性[13]。

本研究結(jié)果顯示，CRP 基因rs1205 位點(diǎn)稀有突變型等位基因是膿毒癥的高危因素，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，分析不同性別、年齡受試者中rs1205 位點(diǎn)SNP 與膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，結(jié)果顯示，不同性別、年齡受試者rs1205 位點(diǎn)SNP 與膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，表明性別、年齡對(duì)rs1205 位點(diǎn)SNP 無(wú)明顯影響。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，rs1205 位點(diǎn)突變型患者血清CRP水平比野生型高。筆者分析原因認(rèn)為，rs1205 位點(diǎn)位于CRP 基因的3’UTR 區(qū)域，該區(qū)域可能處于微小RNA（microRNAs）的靶點(diǎn)區(qū)域，突變可能影響microRNAs 對(duì)CRP 的表達(dá)調(diào)控作用，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)果還顯示，CRP 基因rs3093062 位點(diǎn)GA 和AA 基因型是膿毒癥的危險(xiǎn)因素，攜帶A 等位基因群體是膿毒癥發(fā)生的高危群體。另外，不同性別、年齡受試者中rs3093062 位點(diǎn)SNP 與膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)也不相關(guān)，該位點(diǎn)SNP 也不受年齡和性別的干擾。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，CRP 基因rs3093062 位點(diǎn)突變型受試者血清CRP 蛋白水平較高，說(shuō)明CRP 基因rs3093062 位點(diǎn)突變影響血清CRP 表達(dá)水平。分析原因，筆者認(rèn)為rs3093062 位點(diǎn)位于CRP 基因的啟動(dòng)子區(qū)域，突變可能影響CRP 蛋白的表達(dá)調(diào)控，有研究顯示，rs3093062 位點(diǎn)基因多態(tài)性與血漿CRP 水平有顯著相關(guān)性[14]。此外，Ghaffari 等[15]研究rs3093062位點(diǎn)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，rs3093062 位點(diǎn)GA 和AA 基因型受試者血清CRP 水平顯著高于GG 基因型，與本研究結(jié)果一致。

然而本研究也有不足之處。首先，由于本研究樣本量較小，為了驗(yàn)證本研究結(jié)論的準(zhǔn)確性，可能需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。其次，CRP 基因rs1205 位點(diǎn)和rs3093062 位點(diǎn)位點(diǎn)均位于CRP 基因的非編碼區(qū)，其突變與CRP 表達(dá)水平的相關(guān)性的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，CRP 基因rs1205 位點(diǎn)+1846C＞T 突變和rs3093062 位點(diǎn)-409G＞A 突變與膿毒癥易感性及其嚴(yán)重程度相關(guān)。其機(jī)制可能與突變影響CRP 蛋白表達(dá)有關(guān)，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。