單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)流程及其應(yīng)用

張子祺 張永康 謝輝 孟凡孝

摘 要：細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，是人們的重點(diǎn)研究對(duì)象。闡釋生命活動(dòng)的規(guī)律，就必須要對(duì)細(xì)胞的通訊、免疫、復(fù)制、調(diào)節(jié)等活動(dòng)的生化途徑進(jìn)行深入研究。不同細(xì)胞之間存在“異質(zhì)性”，但傳統(tǒng)上的研究方法無法突破“單細(xì)胞”這一條件的限制，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映的更是多個(gè)細(xì)胞之間的平均結(jié)果，所以有些疾病如“癌癥”無法被精確地檢測(cè)出來，相反單細(xì)胞分析可以更精確地了解每個(gè)細(xì)胞之間的表達(dá)情況，將會(huì)應(yīng)用在很多領(lǐng)域例如：神經(jīng)生物學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)等方面，本文將歸納單細(xì)胞分析的基本流程，并列舉些許應(yīng)用實(shí)例。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序;應(yīng)用;流程

1 緒論

傳統(tǒng)上的細(xì)胞分析方法局限于細(xì)胞群，這種方法存在一定局限性，細(xì)胞群所轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的產(chǎn)物代表這個(gè)細(xì)胞群平均水平，然而低分子量的物質(zhì)卻難以檢測(cè)到，因此我們所得出的結(jié)論就不能應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞，就不能解釋很多現(xiàn)象，例如：同一種藥物施加于同一組織的相鄰的細(xì)胞具有不同的功效。單細(xì)胞分析將研究對(duì)象轉(zhuǎn)移至單個(gè)細(xì)胞，更適合于細(xì)胞的‘異質(zhì)性研究，其在神經(jīng)生物學(xué)、醫(yī)藥方面、微生物、發(fā)育生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

2 基本流程

2.1 分離

分離、獲得單細(xì)胞是單細(xì)胞測(cè)序的第一步，現(xiàn)在有很多分離單細(xì)胞的技術(shù)，例如：顯微操作技術(shù)、激光捕獲切割技術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、微流控技術(shù)等等。[2]熒光激活細(xì)胞分選的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度高，通量大，缺點(diǎn)是需要大量的懸浮細(xì)胞作為材料;顯微操作技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是操作方便成本低，缺點(diǎn)是通量低并且容易損害細(xì)胞;激光捕獲切割優(yōu)點(diǎn)是保護(hù)要捕獲的細(xì)胞，不破壞細(xì)胞周圍組織結(jié)構(gòu)，缺點(diǎn)是價(jià)格高昂;[3]梯度稀釋法的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，但是容易出現(xiàn)分離錯(cuò)誤。

2.2 擴(kuò)增

（1）單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)。首先，將所獲得的單細(xì)胞溶解，獲得微量DNA，其次利將所得到的微量DNA進(jìn)行高效擴(kuò)增，從而獲得高度覆蓋的基因組。其中，擴(kuò)增技術(shù)分為兩類，有如‘兼并核苷酸引物技術(shù)這類基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，以及如：‘多重置換擴(kuò)增技術(shù)這類不基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。不同的擴(kuò)增技術(shù)適用于不同的測(cè)序、分析技術(shù)。

（2）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)。將單個(gè)細(xì)胞的mRNA通過PCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得大量的轉(zhuǎn)錄組。SMART是現(xiàn)今最常用的一種方法，當(dāng)然還有其他諸如：Phi29聚合酶擴(kuò)增技術(shù)、STRT技術(shù)等轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)。

2.3 測(cè)序

單細(xì)胞測(cè)序涉及到兩個(gè)方面：轉(zhuǎn)錄組和基因組，測(cè)序過程中針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的DNA和RNA分別進(jìn)行分析與比較，從而找到基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的差異與變化。[7]

3 應(yīng)用

3.1 單細(xì)胞分析技術(shù)在腫瘤研究方面的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，從細(xì)胞群的角度觀察腫瘤細(xì)胞，無法找出不同細(xì)胞之間的差異，從而會(huì)限制對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究。通過單個(gè)腫瘤細(xì)胞的測(cè)序，我們可以研究腫瘤發(fā)生、新陳代謝的過程，同時(shí)認(rèn)識(shí)各種腫瘤細(xì)胞之間及個(gè)體之間存在差異的起因和腫瘤疾病產(chǎn)生的根源所在。

3.2 單細(xì)胞分析技術(shù)在人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃中的應(yīng)用

人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃的意義在于，它將用于識(shí)別細(xì)胞類型，解釋遺傳變異體，定義病理表征和標(biāo)記，并促進(jìn)相關(guān)試劑如抗體、探針等的開發(fā)，細(xì)胞圖譜的解析需要結(jié)合多種技術(shù)手段，其中建立單細(xì)胞分析平臺(tái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離和鑒定是構(gòu)建細(xì)胞圖譜的前提。

3.3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用

有研究表明當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行分化時(shí)，不同的神經(jīng)細(xì)胞之間存在著差異。（長散在核元件會(huì)通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座在基因組內(nèi)發(fā)生跳躍形成新的插入，而且每個(gè)神經(jīng)元可能含有獨(dú)特的長散在核元件插入，[2]因此神經(jīng)細(xì)胞也適用于細(xì)胞異質(zhì)性的研究。

3.4 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

單細(xì)胞分析應(yīng)用在了很多醫(yī)藥研究方面的領(lǐng)域，借助這一技術(shù)，研究者們可以在單細(xì)胞水平研究許多疾病和生物進(jìn)程，包括神經(jīng)細(xì)胞基因組異質(zhì)性、癌變和腫瘤進(jìn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、早期胚胎發(fā)育和不可培養(yǎng)的細(xì)菌等，極大改變了我們對(duì)這些生物現(xiàn)象的理解。

3.5 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在微生物方面的應(yīng)用

宏基因組技術(shù)，所展現(xiàn)的是環(huán)境中全部的微生物分析結(jié)果，該結(jié)果代表數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)的微生物。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以將從環(huán)境中所得的微生物進(jìn)行逐一分析，從可以將基因組分析具體到單個(gè)微生物，因此，所得到的結(jié)果更貼近于個(gè)體，發(fā)現(xiàn)新的微生物幾率便會(huì)更高。[3]

4 結(jié)語

單細(xì)胞分析技術(shù)和宏基因組技術(shù)相比，其不同之處在于可以分析單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)情況，更好地比較不同單個(gè)細(xì)胞之間的差異，從而揭示傳統(tǒng)上難以解決的問題，如：為什么相鄰的細(xì)胞對(duì)同種藥物反應(yīng)不同;為什么早期癌癥難以被診斷。當(dāng)然它也有當(dāng)今難以解決的問題：擴(kuò)增偏倚性，敏感性低下，容易污染等等。其次，我們可以看到單細(xì)胞分析的應(yīng)用前景相當(dāng)廣泛例如：人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃、神經(jīng)生物學(xué)、醫(yī)藥方面、微生物、發(fā)育生物學(xué)等等領(lǐng)域，都已有研究成果或者有一定的研究潛力。

相信隨著細(xì)胞分選技術(shù)的改進(jìn)，以及全基因組及全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)的不斷完善，單細(xì)胞分析的靈敏度以及準(zhǔn)確度將會(huì)進(jìn)一步提升，該技術(shù)也會(huì)更廣泛的被應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域中。

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作者簡(jiǎn)介：張子祺（1998-），男，山東濟(jì)南人，本科在讀，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程專業(yè)。