參與番茄葉形發(fā)育的TCP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及生物信息分析

張雪瑩 尹一歌 姜 晶 劉 欣

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110161）

TCP 是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其命名源自前3 個(gè)特征基因家族成員：玉米的teosinte branched 1（TB1）基因、金魚草的cycloidea（CYC）基因、水稻的proliferating cell factors（PCFs）基因。TCP結(jié)構(gòu)域是TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族的保守域，是在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的cyc和tbl的保守域中被發(fā)現(xiàn)的（Cubas et al.，1999）。此外，TCP 結(jié)構(gòu)域在信號通路上有3 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)域是與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）基因啟動子特異性結(jié)合以及與DNA結(jié)合所必需的，因此TCP 家族成員可以參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化（Koyama et al.，2010）。

植物特異性轉(zhuǎn)錄因子TCP 家族可以在細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長的耦合中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Ingram &Waites，2006），而植物結(jié)構(gòu)和形態(tài)的生長發(fā)育過程涉及到植物細(xì)胞的增殖、分化和生長（Li et al.，2005），因此TCP 可以通過影響細(xì)胞的增殖和分化來調(diào)控植物的器官形態(tài)（Aguilar &Sinha，2013）。已有大量研究表明，TCP 家族轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育的多個(gè)方面發(fā)揮作用，包括植株衰老、晝夜節(jié)律、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Manassero et al.，2013）、調(diào)控莖尖分生組織（shoot apical meristem，SAM）生長（Koyama et al.，2010）、葉片形態(tài)和大小的變化（Ori et al.，2007）以及側(cè)枝的發(fā)育（Aguilar et al.，2007）等。AtTCP14在擬南芥種子的萌發(fā)過程中能夠激活胚胎的生長潛能（Tatematsu et al.，2008），并且能和AtTCP15共同調(diào)節(jié)節(jié)間長度和葉片大?。↘ieffer et al.，2011）。研究發(fā)現(xiàn)，AtTCP24對擬南芥次生細(xì)胞壁的增厚和花藥內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用（Wang et al.，2015）。在葉用萵苣（生菜）中下調(diào)LsTCP4的表達(dá)會造成葉細(xì)胞分裂異常，植株形成鋸齒狀或卷曲狀的葉緣表型（Seki et al.，2020）。SlBRC1a（SlTCP9）和SlBRC1b（SlTCP7）在番茄腋芽中表達(dá)，其中任一基因活性降低都會使番茄分枝數(shù)增加（Martín et al.，2011）。

葉片作為植物體重要的營養(yǎng)器官，是由SAM生成的扁平側(cè)器官。葉片發(fā)育分為3 個(gè)階段：起始階段、初級形態(tài)階段、次級形態(tài)階段（Kaplan，2001）。起始階段，葉芽在SAM 側(cè)面冒出；初級形態(tài)階段，葉片橫向膨脹，具有邊緣胚芽區(qū)的物種會產(chǎn)生小葉（Berger et al.，2009）；次級形態(tài)階段，組織開始分化，葉片通過細(xì)胞擴(kuò)張而面積增大。葉片的3 個(gè)發(fā)育階段是復(fù)雜的、動態(tài)的過程，是連續(xù)的形態(tài)變化和分子水平的變化，因此研究葉片生長發(fā)育的分子機(jī)制是研究葉片形態(tài)變化的基礎(chǔ)和前提。在植物中，與WUSCHEL相關(guān)的同源基因WOX1可以促進(jìn)葉片外側(cè)生長，而黃瓜CsWOX1突變體表現(xiàn)出異常的葉片形狀和缺陷的次級葉脈，經(jīng)證實(shí)，CsWOX1通過PINOID（CsPID1）控制生長素運(yùn)輸進(jìn)一步在葉脈發(fā)育中發(fā)揮作用；同時(shí)，CsWOX1可能通過與CsTCP4相互作用影響細(xì)胞發(fā)育過程，進(jìn)而改變?nèi)~片最終大?。╓ang et al.，2020）。有研究發(fā)現(xiàn)，NGATHA（NGA）基因家族和STYLISH（STY）基因家族在葉緣的形成中起重要作用（Sohlberg et al.，2006；Martínez et al.，2014），通 過 研 究STY1、STY2雙敲除以及NGA1、NGA2、NGA3、NGA4四敲除的擬南芥突變體表明，其葉片比相應(yīng)野生型的更大、鋸齒更多；相反，過表達(dá)STY1或NGA基因，突變體葉片具有更平滑的葉緣（Kuusk et al.，2002；Alvarez et al.，2009；Trigueros et al.，2009；Lee et al.，2015）。TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、TCP24受miR319 的 調(diào) 控，高 表 達(dá) 的miR319 會下調(diào)以上5 個(gè)TCP基因表達(dá)水平，使擬南芥產(chǎn)生皺縮葉片（Palatnik et al.，2003）。有研究表明，同時(shí)下調(diào)NGAs和miR319 調(diào)控的TCPs，擬南芥葉片形態(tài)發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致葉片邊緣不定生長（Alvarez et al.，2016）。在擬南芥中，TCP與包含LBD 域的asymmetric leaves 2（AS2）TF基因相互作用，抑制了KNOX基因在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)（Li et al.，2012），而KNOX1是分生組織的特征基因，在葉片的起始發(fā)育階段起作用（Bar &Ori，2014）。同樣，參與植物生長發(fā)育的CUC基因家族 中 的TFs、CUC2、CUC3與AtTCP4之 間 相 互作用，調(diào)控葉片的復(fù)雜程度（Rubio-Somoza et al.，2014）。

番茄（Solanum lycopersicum）是一種世界范圍內(nèi)廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物（Teixeira et al.，2005），基因突變和外界生長環(huán)境的改變都會對其葉片造成影響（Kessler et al.，2001）。番茄的葉片為羽狀復(fù)葉，葉片形狀、葉面積大小及小葉數(shù)量是構(gòu)成番茄葉片不同形態(tài)的重要因素（Shleizer et al.，2011）。目前在番茄中已經(jīng)鑒定出30 個(gè)TCP 轉(zhuǎn)錄因 子（Parapunova et al.，2014），其 中l(wèi)anceolate（LA，SlTCP2）能夠調(diào)控番茄葉片生長已被證實(shí)。研究表明，下調(diào)LA的活性可以影響葉緣形態(tài)形成的時(shí)間（Aguilar et al.，2007），LA可以控制葉片的成熟時(shí)間和最終葉形（Shleizer et al.，2011），其突變體會產(chǎn)生小而簡單的葉片。有研究發(fā)現(xiàn)，葉形與果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)，葉片形態(tài)的改變對番茄果實(shí)可溶性固形物含量和產(chǎn)量有促進(jìn)作用（Rowland et al.，2020）。因此，研究番茄葉片生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制對改善其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。本試驗(yàn)通過對可能參與番茄葉形發(fā)育的TCP 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行qRT-PCR，并結(jié)合生物信息分析對可能參與葉片發(fā)育的SlTCPs 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選和特性分析，旨在找出影響葉片發(fā)育的關(guān)鍵TCP 轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究番茄葉片生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019 年9 月至2020 年9 月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。供試番茄品種為Micro-Tom、VF36、Ailsa Craig（AC）、LA2532、LA2922，均 來 自 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子生物學(xué)番茄課題組。55 ℃溫湯浸種催芽后，在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子生物學(xué)番茄課題組土培室進(jìn)行培養(yǎng)。Micro-Tom 取頂端0.5 cm 長的新生葉片（幼嫩葉）和發(fā)育成熟、完整、展開葉片（成熟葉），液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。VF36、AC、LA2532、LA2922 取苗齡50 d 左右且發(fā)育成熟、完整、展開、沒有病蟲害的葉片，液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取和cNDA 合成 利用Trizol 法提取目標(biāo)葉片的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser-Perfect Real Time，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 分析 利用Premier 5.0 軟件，以候選目標(biāo)SlTCPs 轉(zhuǎn)錄因子的序列設(shè)計(jì)引物（表1），委托蘇州泓訊生物科技股份有限公司合成。以番茄組成性表達(dá)基因actin 為內(nèi)參，利用SYBR Green PCR Master Mix（PE Applied Biosystems）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time quantitative）PCR，所有反應(yīng)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT算法并實(shí)時(shí)繪制熔解曲線，驗(yàn)證番茄葉片特異表達(dá)的候選目標(biāo)SlTCPs 轉(zhuǎn)錄因子。利用IBM SPSS Statistics 進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

表1 SlTCPs 轉(zhuǎn)錄因子RT-PCR 引物序列

1.2.3 番茄TCP 基因轉(zhuǎn)錄因子基本信息獲取 利用番茄數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）和NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），查找篩選出參與葉片發(fā)育的候選目標(biāo)SlTCPs 轉(zhuǎn)錄因子的基本信息，獲得相應(yīng)的cDNA 序列和蛋白序列并保存為FASTA 格式，利用DNAMAN 進(jìn)行基因序列比對。

1.2.4 番茄TCP 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 將獲得的候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的氨基酸序列利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protscale/）的ProtParam tool分析氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂溶系數(shù)、疏水指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2.5 番茄TCP 蛋白結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用DNAMAN 比對候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白一 級 結(jié) 構(gòu) 序 列。利 用GenScript（https：//www.genscript.com/psort.html）的PSORT 在 線 預(yù) 測候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的亞細(xì)胞定位。利用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）在線預(yù)測候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的氨基酸成分。

1.2.6 番茄TCP 的保守域、系統(tǒng)進(jìn)化以及保守基序分析 候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線查找，并繪制成圖。利用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇鄰接法，其他參數(shù)默認(rèn)。利用MEME（http：//meme-suite.org/）預(yù)測候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的保守基序，輸出的結(jié)構(gòu)域數(shù)目為10，經(jīng)過顯著性分析后結(jié)構(gòu)域數(shù)目糾正為7。

1.2.7 番茄TCP 的組織表達(dá)分析 以番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫TFGD（http：//ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi）的RNA-Seq 數(shù)據(jù)為參考，研究候選目標(biāo)SlTCPs基因在醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)量。從TFGD 網(wǎng)站的RNA-Seq 數(shù)據(jù)列表中下載醋栗番茄的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，包括不同開花期（0、10、20 d）、熟果期，以及子葉、下胚軸、分生組織、成熟葉、根、幼花蕾、幼葉等不同組織器官。利用MEV 繪制表達(dá)值（FPKM，F(xiàn)ragments per Kilobase Million）熱圖。

1.2.8 番茄TCP 基因啟動子順式作用元件預(yù)測分析 通過番茄數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）獲取候選目標(biāo)SlTCPs基因啟動子序列（轉(zhuǎn)錄起始位置上游1 000 bp 序列）。通過PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析預(yù)測順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 初步篩選與番茄葉片發(fā)育相關(guān)的候選目標(biāo)SlTCPs 基因

根據(jù)番茄基因組數(shù)據(jù)庫，共鑒定出30 個(gè)TCP 轉(zhuǎn)錄因子，其中有18 個(gè)在葉片中相對高表 達(dá)（Parapunova et al.，2014），本 試 驗(yàn) 檢 測了18 個(gè)SlTCP基 因，即SlTCP2、SlTCP3、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP10、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP16、SlTCP17、SlTCP19、SlTCP20、SlTCP22、SlTCP24、SlTCP25、SlTCP27、SlTCP28、SlTCP30在番茄葉片發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果表明（圖1），隨著番茄葉片逐漸成熟，SlTCP11、SlTCP15、SlTCP19的表達(dá)水平極顯著升高；而SlTCP2、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP14、SlTCP22、SlTCP24、SlTCP25表達(dá)水平則顯著或極顯著降低。表明，SlTCP2、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP22、SlTCP24、SlTCP25在葉片發(fā)育進(jìn)程中可能具有重要的調(diào)控作用。對這10 個(gè)目標(biāo)SlTCP基因進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

2.2 候選目標(biāo)SlTCPs 的生物信息分析

2.2.1 番茄TCP 轉(zhuǎn)錄因子基本信息 通過番茄數(shù)據(jù)庫和NCBI 數(shù)據(jù)庫得到10 個(gè)與葉片發(fā)育相關(guān)的候選目標(biāo)SlTCP基因的基本信息（表2）。這10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP基因分布在8 條染色體上，其中1號、4 號染色體上各有2 個(gè)SlTCP基因。序列分析結(jié)果顯示，SlTCPs基因的編碼區(qū)（ORF）長度不等，在606～1 628 bp 之間，且多數(shù)＞1 000 bp。在GenBank 中，SlTCP25基因的登錄號空缺。

表2 番茄TCP 轉(zhuǎn)錄因子的基本信息

2.2.2 番茄TCP 蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)基因組序列分析驗(yàn)證10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP 蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明（表3），SlTCPs 蛋白對應(yīng)編碼的氨基酸長度在201～445 aa 之間，對應(yīng)的分子量在21 246.00～47 550.61 Da 之間。SlTCP2、SlTCP4、SlTCP24 蛋白的等電點(diǎn)＜7，顯酸性；其余SlTCP蛋白的等電點(diǎn)＞7，顯堿性。10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，均為不穩(wěn)定蛋白；疏水指數(shù)均為負(fù)值，均為親水性蛋白。

表3 番茄TCP 蛋白的理化性質(zhì)

2.2.3 番茄TCP 蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及氨基酸成分分析 通過比對候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白序列發(fā)現(xiàn)，在10 個(gè)SlTCP 蛋白的氨基酸序列組成中，位于中間部分約50 aa 長度的氨基酸保守性相對較高，而兩側(cè)的序列保守性較低。從圖2 可以看出，SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19 蛋白在保守域中的相同位點(diǎn)有堿基缺失，這可能是其發(fā)揮不同生物學(xué)功能的原因。

通過亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP 蛋白均主要定位在細(xì)胞核上。對候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白的氨基酸主要組成成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中均含有絲氨酸（Ser），且所占比例相對較高（表4）。絲氨酸在植物生長發(fā)育中起重要作用，包括參與細(xì)胞組織分化、促進(jìn)種子發(fā)芽等；其他主要氨基酸成分如丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、谷氨酸等對植物的光反應(yīng)有影響，丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等對植物響應(yīng)脅迫有積極作用（宗和，2017）。

表4 番茄TCP 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測和主要氨基酸

2.2.4 番茄TCP 蛋白的保守域、系統(tǒng)進(jìn)化以及保守基序分析 利用Pfam 工具鑒定發(fā)現(xiàn)，候選目標(biāo)SlTCPs 蛋白均含有不完整的TCP 結(jié)構(gòu)域（圖3）。10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP 蛋白序列通過多重序列比對及采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，本試驗(yàn)構(gòu)建的進(jìn)化樹與Parapunova 等（2014）研究所得進(jìn)化樹分支一致。這10 個(gè)基因分屬TCP 家族的兩大類別：Class Ⅰ和Class Ⅱ。SlTCP19、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15屬 于Class Ⅰ；SlTCP2、SlTCP24、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP22、SlTCP25屬于Class Ⅱ，其中SlTCP2、SlTCP24、SlTCP4屬 于CIN-like 亞 類，SlTCP8、SlTCP22、SlTCP25屬于CYC/TB1 亞類。通過MEME 預(yù)測番茄TCP 蛋白的保守基序（圖4），10 個(gè)候選SlTCP蛋白含有7 種主要基序，其中基序1 保守性最高，是TCP 蛋白的共有基序；SlTCP4、SlTCP24、SlTCP2、SlTCP8、SlTCP22、SlTCP25含有基序2，SlTCP19、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15含有基序5，分類結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支相同。同時(shí)，部分SlTCPs 在系統(tǒng)進(jìn)化樹中分支相近，表明其在功能上可能存在冗余。

2.2.5 番茄TCP 基因的表達(dá)分析 利用TFGD 網(wǎng)站在線分析候選目標(biāo)SlTCPs基因在醋栗番茄中不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)模式。分析醋栗番茄不同發(fā)育時(shí)期不同組織器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，候選目標(biāo)SlTCPs基因在不同組織器官中存在特異性表達(dá)，在不同發(fā)育時(shí)期的相同組織器官中的表達(dá)水平也存在明顯差異（圖5）。SlTCP11、SlTCP15、SlTCP24在各個(gè)時(shí)期的不同組織器官中，均有相對較高的表達(dá)水平；SlTCP2在花、未成熟果實(shí)、子葉、葉片中表達(dá)水平較高；SlTCP14在下胚軸、營養(yǎng)分生組織、花芽、幼嫩葉中表達(dá)水平較高。在成熟葉中，SlTCP2表達(dá)量最高，是SlTCP14、SlTCP15表達(dá)量的2 倍，但在幼嫩葉中SlTCP24表達(dá)量最高，是SlTCP15表達(dá)量的3 倍。而SlTCP25在所有組織器官中的表達(dá)量都很低，幾乎不表達(dá)。其中SlTCP4、SlTCP8、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP22、SlTCP24在幼嫩葉和成熟葉中的差異表達(dá)水平與qRT-PCR 結(jié)果相一致；但SlTCP2、SlTCP11、SlTCP25在幼嫩葉和成熟葉中的表達(dá)水平相近，與qRT-PCR 結(jié)果略有差異。

對SlTCPs基因轉(zhuǎn)錄起始上游1 000 bp 的全部順式作用元件進(jìn)行分析，篩選后將其分成三類（圖6）。在所有分析的候選目標(biāo)SlTCPs基因中，光反應(yīng)相關(guān)元件占比最大，為50.00%；環(huán)境脅迫相關(guān)元件占比約為45.35%，生長發(fā)育相關(guān)元件占比約為4.65%。SlTCP4含有最多數(shù)量的光反應(yīng)相關(guān)作用元件，SlTCP2含有最多種類的脅迫相關(guān)作用元件，SlTCP4、SlTCP8、SlTCP25含有與生長發(fā)育相關(guān)的作用元件?？梢钥闯?，候選目標(biāo)SlTCPs基因均可能參與到光反應(yīng)路徑中，并可能對脅迫應(yīng)答、激素調(diào)節(jié)、生長發(fā)育起作用。

2.3 不同番茄葉形突變體中關(guān)鍵SlTCPs 基因的表達(dá)水平分析

番茄突變體LA2532 的葉片為葉裂加深，且有3～4 對二級小葉的復(fù)雜葉片結(jié)構(gòu)，而突變體LA2922 的葉片為多個(gè)小葉整合到一整片葉的葉片結(jié)構(gòu)（Hareven et al.，1996）。利用番茄兩種不同葉形突變體LA2532、LA2922 鑒定SlTCPs基因的差異表達(dá)水平。結(jié)果表明（圖7、8），與野生型相比，SlTCP8在兩種葉形突變體中的表達(dá)水平要顯著高于其他SlTCPs基因的表達(dá)水平。SlTCP4、SlTCP8、SlTCP22、SlTCP25等4 個(gè)SlTCP基 因在LA2532、LA2922 中的表達(dá)水平顯著高于在野生型中的表達(dá)水平，表現(xiàn)出相同的表達(dá)趨勢。但 是SlTCP2、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP24在LA2532 中表達(dá)水平高于在野生型中的表達(dá)水平，而在LA2922 中表達(dá)趨勢則與野生型相反。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在番茄已鑒定的30 個(gè)TCP 轉(zhuǎn)錄因子中（Parapunova et al.，2014），選出18 個(gè)在葉片中高表達(dá)的候選SlTCP基因作為研究對象，結(jié)合番茄葉片不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平的差異，篩選出10 個(gè)SlTCP基因（SlTCP2、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP22、SlTCP24、SlTCP25），并對其進(jìn)行生物信息分析。同時(shí)，利用番茄兩種葉形突變體LA2922、LA2532 對候選SlTCPs基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，最終選出可能參與番茄葉形發(fā)育的關(guān)鍵基因SlTCP2、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP24。

10 個(gè)候選目標(biāo)SlTCP 的基因序列和蛋白序列分布在8 條染色體上，編碼區(qū)（ORF）長度不等，且SlTCPs 蛋白表現(xiàn)出不同的酸堿性。SlTCPs 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測均在細(xì)胞核上，推測其參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，可能對番茄生長發(fā)育進(jìn)程造成直接影響。10 個(gè)候選SlTCP基因的啟動子序列具有三類作用元件，可能參與番茄生長發(fā)育中的光反應(yīng)、低溫誘導(dǎo)、脅迫應(yīng)答及激素調(diào)節(jié)。10 個(gè)候選SlTCP 蛋白均含有絲氨酸，且絲氨酸對植物的生長發(fā)育有積極作用（宗和，2017）。綜上所述，10 個(gè)候選SlTCP基因均可能在番茄的生長發(fā)育過程中起到一定的作用。

根據(jù)TCP 結(jié)構(gòu)域的同源性，TCP 蛋白可分為兩大類：Class Ⅰ和Class Ⅱ。其中Class Ⅱ又分為兩個(gè)亞類，即CYC/TB1、CIN-like。ClassⅠ和Class Ⅱ都包括轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子（Manassero et al.，2013）。本試驗(yàn)中，SlTCP2、SlTCP4、SlTCP8、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP22、SlTCP24、SlTCP25等10 個(gè)SlTCP 蛋白均含有TCP 蛋白保守結(jié)構(gòu)域，且具有一段相同的保守基序。在蛋白序列比對中，SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19 與 其他SlTCPs 蛋白相比氨基酸序列有明顯不同，且保守結(jié)構(gòu)域相差較大。在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19在同一分支上，其他SlTCPs基因在另一分支上，與前人的研究結(jié)果相符（Parapunova et al.，2014）。SlTCP2和SlTCP24在相同的分支Class Ⅱ上，同屬CINlike 亞類，且SlTCP2和SlTCP24的理化性質(zhì)相近，組織特異性表達(dá)的水平也相似。在進(jìn)化樹中，同一分支的SlTCPs基因結(jié)構(gòu)更為相似，而基因結(jié)構(gòu)越相似，其功能也越相似。在已報(bào)道的番茄TCP 家族中，SlTCP2可以調(diào)控葉片的發(fā)育進(jìn)程及葉原基形成的動態(tài)變化（Shleizer et al.，2011），由此推測SlTCP24可能與SlTCP2在功能上有相似性。在已報(bào)道的參與植物葉形調(diào)控的TCP 轉(zhuǎn)錄因子中，屬于Class Ⅱ分支上的TCP 轉(zhuǎn)錄因子較多，本試驗(yàn)篩選出的SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19同屬于Class Ⅰ分支，蛋白結(jié)構(gòu)上的差異可能會導(dǎo)致SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19在調(diào)控番茄葉形機(jī)制上較其他SlTCPs基因表現(xiàn)出差異。葉片主要依靠細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張來促進(jìn)葉片生長（Manassero et al.，2013），而TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化的調(diào)控中起重要作用（Koyama et al.，2010），進(jìn)而影響植物葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育。TCP基因通過與許多分子和信號傳導(dǎo)元件相互作用，在生物信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著核心作用（Dhaka et al.，2017）。例如，受miR319控制的TCP和NGA聯(lián)合敲除對葉形發(fā)育有顯著的加性影響（Alvarez et al.，2016）；TCP和CUC通過競爭形成復(fù)合物來調(diào)控葉片形態(tài)（Rubio-Somoza et al.，2014）。這些特性使TCP成為研究植物中組合基因表達(dá)和激素串聯(lián)機(jī)制的理想候選者（Dhaka et al.，2017）。

從組織特異性表達(dá)分析結(jié)果可以看出，SlTCP11、SlTCP15、SlTCP24在所有組織器官中均有相對較高的表達(dá)。隨著葉片發(fā)育進(jìn)程的變化，SlTCP4、SlTCP8、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP22、SlTCP24的表達(dá)水平明顯發(fā)生改變，因此SlTCPs可能在葉片不同發(fā)育時(shí)期發(fā)揮不同作用。以上大部分SlTCPs基因與TFDG 網(wǎng)站預(yù)測的各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平相符，但SlTCP2、SlTCP11、SlTCP25在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平與預(yù)測略有差異，因此分析造成其表達(dá)結(jié)果差異的原因可能是由于番茄品種不同及預(yù)測誤差所造成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SlTCP2、SlTCP11、SlTCP14、SlTCP15、SlTCP19、SlTCP24在番茄兩種不同葉形突變體的葉片中表達(dá)水平呈相反趨勢，推測其可能對控制番茄復(fù)葉數(shù)量及葉裂形成具有重要作用。

目前TCP 轉(zhuǎn)錄因子在多種植物中被證明對植株生長發(fā)育，尤其是葉片形態(tài)的調(diào)控起重要作用，但是在具有復(fù)葉典型特征的番茄葉片中的研究還不夠深入和廣泛。已知SlTCP2對番茄葉片形態(tài)的構(gòu)成具有重要調(diào)控作用（Shleizer et al.，2011），而其他SlTCPs基因在番茄葉片形態(tài)調(diào)控上的作用尚不清楚，本試驗(yàn)結(jié)果為探究TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族在番茄葉片形態(tài)構(gòu)成中的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于番茄SlTCPs家族成員對番茄葉片發(fā)育的具體調(diào)控功能，還有待通過基因編輯和分子生物學(xué)等手段進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。