基于高通量測序技術(shù)的中溫大曲中微生物群落多樣性解析

胡曉龍 王康麗 牛廣杰 喬亞娟 張玉 何培新

摘要：采用高通量測序技術(shù)對河南省某酒企中溫大曲曲皮和曲心兩個部位的真菌群落和細(xì)菌群落的多樣性及其組成進行了研究.結(jié)果表明：1）中溫大曲曲皮樣品中真菌群落多樣性和豐度均高于曲心樣品;子囊菌門是大曲曲皮和曲心樣品中的唯一優(yōu)勢菌門;大曲樣品中共檢測到15種真菌，其中扣囊復(fù)膜孢酵母、雪黃散囊菌和畢赤酵母sp1為曲皮和曲心樣品中的優(yōu)勢真菌，扣囊復(fù)膜孢酵母在曲皮和曲心樣品中的含量基本一致，而雪黃散囊菌和畢赤酵母sp1在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.2）中溫大曲曲心樣品中細(xì)菌群落多樣性高于曲皮樣品，但其豐度低于曲皮樣品;在大曲樣品中共檢測到28個屬，其中腸桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、布氏桿菌屬、腸球菌屬和歐文氏菌屬為大曲樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，除布氏桿菌屬外，其他優(yōu)勢細(xì)菌屬在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.

Abstract：The diversity and? structure of fungal and bacterial communities in Qupi and Quxin of medium temperature Daqu from one wine corporation located in He′nan were analyzed based on the high|throughput sequencingtechnology.The results showed that：1） The diversity and abundance of fungal community in Qupi were higher than those in Quxin samples，and Ascomycetes was the only dominant fungi detected both in Qupi and Quxin.A total of 15 species of fungi was detected in Daqu，of which Saccharomycopsis fibuligera，Eurotium niveoglaucum，Pichia sp1 were the dominant fungi in Qupi and Quxin samples.Among them，the content of Saccharomvcopsis fibuligera in Qupi was similar to that in Quxin，however，the contents of Eurotium niveoglaucum and Pichia sp1 in Qupi and Quxin samples were quite different.2） The diversity of bacterial community in Quxin of medium temperature Daqu was higher than that of Qupi，but its abundance was lower than that of Qupi.A total of 28 genera was detected in the Qupi and Quxin samples，of which Enterobacter，Lactobacillus，Lactococcus，Brucella，Enterococcus and Erwinia were dominant bacteria of Daqu samples.Expect for Brucella，the content of other dominant bacteria had a large difference in Qupi and Quxin.

關(guān)鍵詞：白酒;中溫大曲;微生物群落;高通量測序技術(shù)

Key words：Chinese liquor;medium temperature Daqu;microbial community;high|throughput sequencing technology

中圖分類號：TS261.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.04.004

文章編號：2096-1553（2019）04-0021-09

0 引言

曲作為一種糖化劑、發(fā)酵劑、產(chǎn)香劑和原料，在制酒、制醋、制醬油等傳統(tǒng)釀造行業(yè)的應(yīng)用已有幾千年的歷史.其中，大曲主要用于白酒固態(tài)發(fā)酵[1]，其品質(zhì)的優(yōu)劣在很大程度上決定了白酒的品質(zhì)和風(fēng)格.大曲主要是以大麥、小麥、豌豆等單一或多種谷物為原料，經(jīng)破碎、加水混合再壓成塊狀曲醅[2]，經(jīng)自然或人工接種并在適宜的溫度和濕度條件下進行固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)成型、控溫、貯存等十幾個環(huán)節(jié)而制成塊曲或磚曲.制曲過程中，純種或環(huán)境中的微生物在適宜的條件下經(jīng)過長時間的富集和培養(yǎng)，可在曲醅表面和內(nèi)部形成有益的釀酒微生物群系[3].大曲微生物菌群復(fù)雜，主要集中在酵母菌、霉菌和細(xì)菌三類菌中，三者在釀酒過程中的糖化、產(chǎn)香、產(chǎn)酒方面可以協(xié)同作用，但各自側(cè)重不同[4]：酵母菌有酒化和酯化的作用;霉菌助產(chǎn)一些生物酶，如紅曲霉和米根霉產(chǎn)酯化酶，黑曲霉助產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和糖化酶[5-6];細(xì)菌助產(chǎn)一些呈香物質(zhì)，如吡嗪類化合物、愈創(chuàng)木酚、苯甲醛、乳酸、芳香族化合物等多種香氣成分.此外，大曲中還有少量的放線菌，其功能雖然尚不明確，但其可以產(chǎn)生蛋白酶，使蛋白質(zhì)分解成氨基酸，進而與淀粉分解生成的糖反應(yīng)會產(chǎn)生醛、酮、吡嗪類化合物等香味物質(zhì).

目前，關(guān)于大曲群落信息研究的報道很多[7-8]，其所采用的方法包括傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法[9]、傳統(tǒng)分子生態(tài)學(xué)方法（16s rDNA克隆文庫法[10]、PCR|DGGE[11]，擴增核糖體DNA限制性分析[12]和PLFA[13]等）和高通量測序技術(shù)[14].尤其是高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，使得大曲中痕量微生物和不可培養(yǎng)微生物得以被發(fā)現(xiàn)，極大地豐富了人們對大曲中微生物群落多樣性的認(rèn)識.目前對產(chǎn)自四川、貴州等地區(qū)的大曲微生物的研究較多，但對產(chǎn)自河南地區(qū)的大曲微生物群落的研究相對較少，且對產(chǎn)自河南地區(qū)的大曲曲皮和曲心微生物群落差異尚不明晰.基于此，本文擬采用高通量測序技術(shù)研究河南地區(qū)中溫大曲曲皮和曲心兩個部位的微生物群落多樣性及其組成，以期拓展對河南地區(qū)中高溫大曲中微生物種類的研究，在一定程度上豐富對我國不同地區(qū)中溫大曲微生物多樣性的認(rèn)識.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 樣品采集 中溫大曲樣品，取自河南某知名酒廠，取曲塊表面厚度約為1 cm的大曲作為曲皮樣品，粉碎后備用; 在曲塊中心，取長、寬、厚均為5 cm的正方體作為曲心樣品，粉碎后備用.

1.1.2 主要試劑 2×Taq PCR MasterMix，上海天根生物公司產(chǎn);引物ITS1/ITS4和515F/806R，

氯化鈉、苯酚、氯仿，生工生物上海股份有限公司產(chǎn);無水乙醇，上海聯(lián)碩生物技術(shù)有限公司產(chǎn);Triton X-100，上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn);SDS，美國Amresco公司產(chǎn);Tris，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn);EDTA，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);醋酸銨，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.

1.1.3 主要儀器 MP200A型精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司產(chǎn); TG16-WS型臺式高速離心機，安徽中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);DKY-Ⅱ型恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床，倍輝北京產(chǎn)品部產(chǎn);ZDX-35B型滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械廠產(chǎn);SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn);JY92-Ⅲ型PCR儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn);DYY-8C型瓊脂糖電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取

1.2.1.1 樣品預(yù)處理 分別稱取7 g大曲曲皮和曲心樣品，用20 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS緩沖液懸浮，加入3—5顆玻璃珠，漩渦振蕩5 min后在300 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，沉淀用PBS緩沖液重復(fù)洗滌3次，離心后合并上清液.將上清液于9000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀.再用 5 mLPBS緩沖液重復(fù)洗滌3次，每次于9000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，收集細(xì)胞沉淀.最后將細(xì)胞沉淀用1.5 mL PBS緩沖液重新懸浮，該懸浮液用于基因組提取.

1.2.1.2 DNA的提取 上述懸浮液中DNA的提取參照H.Y.Wang等[15]的方法.

1.2.2 PCR擴增與高通量測序 采用原核微生物16S rRNA基因序列V4可變區(qū)設(shè)計的通用引物515F/806R[16]和真核生物通用引物ITS1/ITS4分別對上述基因組進行PCR擴增，兩種引物的PCR擴增和高通量測序方法分別參照胡曉龍[17]和朱文優(yōu)[18]的方法進行.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

1.2.3.1 序列質(zhì)量控制 采用Cutadapt（v1.9.1），Vsearch（1.9.6），Qiime（1.9.1）分析軟件對所測原始序列進行質(zhì)量控制：首先，將每對雙向測序的序列進行比對，根據(jù)比對的末端重疊區(qū)進行拼接，拼接時保證至少有20 bp的重疊區(qū)，去除拼接結(jié)果中含有N的序列;接著，去除引物和接頭序列，去除兩端質(zhì)量值低于 20 bp的堿基，去除長度小于200 bp的序列;最后，將上面拼接過濾后的序列與數(shù)據(jù)庫進行比對，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù).

1.2.3.2 操作分類單元（OTU）分析 采用Qiime′s uclust程序?qū)⑾嗨贫葹?7%的有效序列歸為一個OTU，并確定每個OTU的代表序列[17].將獲得的每個OTU的代表序列與RibosomalDatabase Project（RDP）在線數(shù)據(jù)庫進行比對，選取置信度為80%的閾值對上述序列進行分類，進而確定每個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬、種水平.

2 結(jié)果與討論

2.1 大曲樣品中真菌群落多樣性及其組成分析

2.1.1 大曲真菌群落多樣性

大曲真菌群落稀疏曲線如圖1所示.由圖1可知，當(dāng)測序深度超過10 000序列時，曲皮和曲心樣品中真菌群落Observed OTU數(shù)目基本不再增加，稀疏曲線趨于平緩.由于本實驗所測序列深度遠(yuǎn)高于10 000條，因此，本文所選取樣品有效測序數(shù)量能夠較全面地反映待測大曲樣品的真菌群落多樣性信息.

大曲真菌群落多樣性指數(shù)見表1.由表1可知，經(jīng)過Illumina Miseq高通量測序和序列質(zhì)量控制，曲皮和曲心樣品中真菌菌群中所得有效序列分別為66 850條和 70 954條.曲皮樣品中真菌群落的Shannon和 Chao1指數(shù)均略高于曲心樣品，表明曲皮樣品中真菌群落多樣性和豐度高于曲心樣品.這可能是由于在制曲和存放過程中曲皮和空氣或地面直接接觸，氧氣充足，而曲心溫度高于曲皮且氧含量低于曲皮，進而導(dǎo)致曲皮真菌群落多樣性和豐度高于曲心，這與李燕榮等[19]的研究結(jié)果一致.

2.1.2 大曲真菌群落組成 大曲曲皮和曲心樣品中真菌群落組成如圖2所示.由圖2可知，代表性O(shè)TU序列的物種注釋結(jié)果表明，除“門”水平外，大曲曲皮和曲心樣品在不同分類水平上存在一定的差異.

在“門”水平（圖2a）），子囊菌門（Ascomycota）是曲皮和曲心樣品中的唯一優(yōu)勢（相對含量≥1%）菌門，相對含量均大于99%，同時也是四川和安徽等地區(qū)中溫大曲中的優(yōu)勢真菌菌門[18，20].

在“綱”水平（圖2b）），酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）為大曲樣品中的優(yōu)勢真菌，且其中酵母綱的相對含量遠(yuǎn)高于散囊菌綱的相對含量;較之于曲心，曲皮樣品中酵母綱相對含量較高，散囊菌綱相對含量較低.

在“目”水平（圖2c）），酵母菌目（Saccharomycetales）和散囊菌目（Eurotiales）為大曲樣品中的優(yōu)勢微生物，同時也含有少量的毛霉目（Mucorales）.

在“科”水平（圖2d）），共檢測到9個科，其中復(fù)膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）、畢赤酵母科（Pichiaceae）和酵母科（Saccharomycetaceae）為大曲樣品中的優(yōu)勢菌科，其在曲皮和曲心樣品中的平均相對含量分別為65.3%，27.2%，3.5%和2.2%.較之于曲心樣品，曲皮中畢赤酵母科（6.3%）和酵母科（4.1%）的相對含量較高;復(fù)膜孢酵母科在曲皮（65.4%）和曲心（65.2%）中的相對含量差別不大;發(fā)菌科（23.3%）的相對含量較低.

在“屬”水平（圖2e）），共檢測到14個屬，其中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、散囊菌屬（Eurotium）、畢赤酵母屬（Pichia）和酵母屬（Saccharomyces）為大曲樣品中的4個優(yōu)勢菌屬，其在曲皮和曲心樣品中的平均相對含量分別為65.3%，26.3%，3.5%和2.2%.盡管復(fù)膜孢酵母屬和畢赤酵母屬是不同地域中溫大曲樣品共有的優(yōu)勢微生物，但不同地域中溫大曲樣品整體的優(yōu)勢微生物組成存在明顯的差異，如安徽某酒廠中溫大曲中有7種優(yōu)勢真菌，四川某酒廠中溫大曲中則有10多種優(yōu)勢真菌[18，20]，這主要是由于地理環(huán)境、水源、氣候、工藝等的不同所造成的微生物群落的區(qū)域差異.此外，復(fù)膜孢酵母屬在曲皮樣品（65.4%）中和曲心樣品（65.2%）中的相對含量基本相同;而散囊菌屬在曲皮樣品（23.2%）中的相對含量低于曲心樣品（29.3%）;畢赤酵母屬和酵母屬在曲皮樣品（6.3%和4.1%）中的相對含量均遠(yuǎn)高于曲心樣品（0.8%和0.3%）.

在“種”水平（圖2f）），共檢測到15個種，其中扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、雪黃散囊菌（Eurotium niveoglaucum）和畢赤酵母sp1（Pichia sp1）為曲皮和曲心樣品中的優(yōu)勢真菌，其在曲皮和曲心樣品中的平均相對含量分別為 65.3%，26.1%和3.4%.在優(yōu)勢真菌組成上，曲皮和曲心樣品中扣囊復(fù)膜孢酵母含量基本一致，分別為 65.4%和65.2%;雪黃散囊菌在曲皮樣品（23.0%）中的含量低于曲心樣品（29.2%）;畢赤酵母sp1在曲皮樣品（6.1%）中含量遠(yuǎn)高于曲心樣品（0.7%）.

2.2 大曲樣品中細(xì)菌群落多樣性及其組成分析

2.2.1 大曲細(xì)菌群落多樣性 經(jīng)過Illumina Miseq高通量測序和序列質(zhì)量控制，曲皮和曲心樣品中細(xì)菌菌群中所得有效序列分別為42 590條和 50 323條，其平均長度大小分別為459 bp和462 bp.通過圖3所示大曲細(xì)菌群落稀疏曲線可以看出，測序深度大于10 000條時，稀疏曲線趨于平緩，由于本實驗所測序列深度遠(yuǎn)高于10 000條，因此，本文所選取樣品有效測序數(shù)量能夠充分反映待測大曲樣品的細(xì)菌群落多樣性信息.

由表1可知，曲心樣品中細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)高于曲皮樣品，表明曲心樣品中細(xì)菌群落多樣性高于曲皮樣品.但是，曲皮樣品中細(xì)菌群落Chao1指數(shù)高于曲心樣品，表明曲皮樣品中細(xì)菌群落豐度略高于曲心樣品，這一研究結(jié)果與李登勇等[21]發(fā)現(xiàn)的高溫大曲細(xì)菌群落分布規(guī)律相近.

2.2.2 大曲細(xì)菌群落組成 大曲曲皮和曲心樣品中細(xì)菌群落組成如圖4所示.由圖4可知，曲皮和曲心部位細(xì)菌群落組成在門、綱、目、科、屬、種水平上均存在一定的差異.

在“門”水平（圖4a）），共檢測到5個門.其中變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為曲皮和曲心樣品中的優(yōu)勢菌門，其在曲皮和曲心樣品中的平均含量分別為79.6%和17.1%.較之于曲心樣品，曲皮中的變形菌門相對含量較高，厚壁菌門相對含量較低，而酸桿菌門僅在曲皮樣品中可以檢測到.

在“綱”水平（圖4b）），共檢測到10個綱，其中γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）為大曲樣品中的優(yōu)勢菌綱.較之于曲心樣品，曲皮中的γ-變形菌綱相對含量較高，而芽孢桿菌綱相對含量（9.9%）明顯低于曲心（24.2%）.此外，Deltaproteobacteria，Holophagae，vadinHA17和鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）4種綱僅在曲皮樣品中可以檢測到.

在“目”水平（圖4c）），共檢測到12個目，其中腸桿菌目（Enterobacteriales）、乳桿菌目（Lactobacillales）和根瘤菌目（Rhizobiales）為大曲樣品中的優(yōu)勢菌目.腸桿菌目在曲皮樣品中的相對含量（82.7%）高于在曲心樣品中的相對含量（73.2%）;乳酸桿菌目在曲皮中的相對含量（8.2%）遠(yuǎn)低于在曲心樣品中的相對含量（24%）;根瘤菌目在曲皮中的相對含量（1.3%）和在曲心中的相對含量（1.4%）基本相同.

在“科”水平（圖4d）），共檢測到19個科，其中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）

和布魯氏菌科（Brucellaceae）為大曲樣品中的優(yōu)勢菌科.曲皮樣品中腸桿菌科的相對含量（82.7%）和乳桿菌科的相對含量（2.5%）均高于其在曲心樣品中的含量（分別為73.2%和0.6%）;而曲皮樣品中鏈球菌科的相對含量（4.9%）和腸球菌科的相對含量（0.4%）明顯低于其在曲心樣品中的相對含量（分別為18.6%和4.7%）.

在“屬”水平上（圖4e）），共檢測到28個屬，其中腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、布氏桿菌屬（Brucella）、腸球菌屬（Enterococcus）和歐文氏菌屬（Erwinia）為大曲樣品中的優(yōu)勢菌屬，其含量分別占曲皮和曲心細(xì)菌含量的90.0%和97.8%，且腸桿菌屬含量明顯高于其他優(yōu)勢菌屬.腸桿菌屬和腸球菌屬也是四川和貴州某些高溫大曲中的優(yōu)勢微生物，其主要代謝產(chǎn)物包括乳酸等，有助于香氣物質(zhì)乳酸乙酯的形成，并有效抑制雜菌的生長[21].上述優(yōu)勢細(xì)菌中除布氏桿菌屬外，其余5個優(yōu)勢細(xì)菌屬在曲皮和曲心樣品中含量差異較大.

在“種”水平（圖4f）），共檢測到38個種，其中布魯氏菌（Brucella microti）、腸桿菌（Enterobacter cloacae）、煙性腸桿菌（Enterobacter tabaci）、鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）、Erwiniagerundensis和格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）為大曲樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌，其在曲皮和曲心樣品中平均含量分別為1.2%，62.8%，10.4%，2.5%，4.0%和11.7%.在優(yōu)勢細(xì)菌組成上，腸桿菌和煙性腸桿菌曲皮含量高于曲心樣品;鶉雞腸球菌、Erwinia gerundensis和格氏乳球菌在曲皮樣品中的含量遠(yuǎn)低于曲心樣品;布魯氏菌在曲皮和曲心樣品含量基本一致.

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對河南某酒企中溫大曲樣品中的真菌群落和細(xì)菌群落多樣性及其組成進行了解析，主要結(jié)論如下：

1）中溫大曲曲皮樣品中真菌群落多樣性和豐度均高于曲心樣品;子囊菌門是大曲曲皮和曲心樣品中的唯一優(yōu)勢菌門，其在曲皮和曲心樣品中的相對含量均大于99%;大曲樣品中共檢測到15種真菌，其中扣囊復(fù)膜孢酵母、雪黃散囊菌、畢赤酵母sp1為曲皮和曲心樣品中的優(yōu)勢真菌，

扣囊復(fù)膜孢酵母在曲皮和曲心樣品中的含量基本一致，分別為65.4%和 65.2%，而雪黃散囊菌和畢赤酵母sp1在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.

2）中溫大曲曲心樣品中細(xì)菌群落多樣性高于曲皮樣品，但其豐度低于曲皮樣品;在曲皮和曲心樣品中共檢測到28個屬，其中腸桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、布氏桿菌屬、腸球菌屬和歐文氏菌屬為大曲樣品中的6個優(yōu)勢細(xì)菌屬，除布氏桿菌屬外，其他優(yōu)勢細(xì)菌屬在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.

該結(jié)果在一定程度上豐富了對我國不同地區(qū)中溫大曲微生物群落多樣性的認(rèn)識，同時為今后科學(xué)設(shè)計或選用多種培養(yǎng)方法定向分離大曲功能微生物，以及在實際生產(chǎn)過程中合理配比曲皮和曲心樣品提供了一定的理論依據(jù).

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