獸醫(yī)實驗室抗體檢測結(jié)果影響因素的分析及注意事項

周俊宇

摘 要 隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的進步發(fā)展以及國家動物疫病檢測計劃的實施和地方動物疫病預(yù)防與控制工作的進行，基層獸醫(yī)實驗室的發(fā)展也逐漸完善，動物免疫抗體檢測在動物疫病的防治上發(fā)揮出了巨大的作用，但是其在實驗過程中也因各種因素而導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)異常，繼而影響動物疫病防治的效果?；诖?，本文結(jié)合牛血清A型口蹄疫抗體檢測實驗就影響獸醫(yī)實驗室抗體檢測結(jié)果的因素及對策進行了分析。

關(guān)鍵詞 獸醫(yī)實驗室；抗體檢測；影響因素；注意事項

1 引言

抗體檢測工作的開展能夠針對一些畜禽疾病進行有效的檢測，以便提出更好的診療辦法，但是實驗室在實際操作中，往往會因為試劑因素、樣品因素以及人為因素造成檢測結(jié)果失真的現(xiàn)象，由此有必要深入分析其影響因素，并積極采取措施規(guī)范實驗室操作，確保檢測結(jié)果的精確有效，以便為基層獸醫(yī)實驗室的工作開展提供依據(jù)。

2 影響獸醫(yī)實驗室抗體檢測結(jié)果的因素

2.1 試劑因素

實驗過程中使用的如陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)抗原、稀釋液以及陰性血清等試劑都會直接影響到抗體檢測質(zhì)量，因此需要嚴(yán)格注意ELISA 檢測相關(guān)試劑盒的購買情況，使用過程中還需要注意ELISA 檢測試劑盒生產(chǎn)日期及保存環(huán)境溫度，如果保存不當(dāng)或者是過期都有可能會出現(xiàn)錯誤，影響抗體檢測結(jié)果。

2.2 樣品因素

待檢樣本的質(zhì)量是確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，如果被檢樣品被污染就可能導(dǎo)致 ELISA 敏感性和準(zhǔn)確性降低，因此在樣品采集過程中應(yīng)嚴(yán)格注意樣品采集的方式、時間以及樣品的前期處置和保管工作。在抗體檢測過程中，還需要注意不能重復(fù)多次凍融樣品，以免樣品的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞而出現(xiàn)錯誤的檢測結(jié)果。

2.3 人為操作因素

2.3.1 加樣操作因素

在檢測過程中加樣成為影響檢測結(jié)果主要因素，尤其是人為加樣過程中，必須要保證加樣的均勻、定量，不能出現(xiàn)氣泡。需要注意加樣之前的樣品確保是在完全解凍的狀態(tài)下，加樣后必須要完全混合均勻才能夠進行檢測工作，否則就會出現(xiàn)特異性反應(yīng)。

2.3.2 溫育時間與溫度

ELISA 檢測相關(guān)抗體時需要進行孵育來使被檢樣品和所包被抗原或者抗體更好的結(jié)合，因此需要參照說明書要求對不同類型抗體檢測過程進行孵育，如果時間、溫度控制不當(dāng)還有可能造成被檢樣品不能與抗體或者抗原結(jié)合形成抗原符合物，使得實驗結(jié)果嚴(yán)重失真。

2.3.3 洗板次數(shù)因素

ELISA 檢測相關(guān)抗體需要自加完二抗進行孵育后進行洗板工作，但是洗滌次數(shù)過多容易洗掉反應(yīng)結(jié)合的復(fù)合物，洗板次數(shù)過少導(dǎo)致洗滌不干凈，容易造成二抗稀釋液的殘留，導(dǎo)致實驗結(jié)果失真。

3 獸醫(yī)實驗室血清學(xué)抗體檢測操作應(yīng)用

使用?？谔阋逜型抗體檢測過程作為實例分析講解基層獸醫(yī)實驗操作的注意事項， 以待提高實驗室抗體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.1 實驗用品的準(zhǔn)備

首先，準(zhǔn)備好實驗中需要用到的儀器耗材，包括酶標(biāo)儀（型號：MK3）、深圳某生物公司生產(chǎn)的合格期內(nèi)的試劑盒、高壓滅菌鍋、離心機、純水機、均質(zhì)器等。其次，制備待檢血清，要求血清清亮，無溶血，共10份樣品。

3.2 實驗器材的消毒

除了實驗中需要用到的一次性用具可以直接使用以外，其他可重復(fù)使用的實驗用具必須要用烘箱或者高壓滅菌進行消毒才能夠使用。

3.3 實驗操作的過程

3.3.1 ?？谔阋逜型抗體檢測試驗基本步驟：

1.試驗設(shè)置陽性對照1孔、陰性對照2孔；

2.加樣：將陰性對照、陽性對照、待檢樣品血清按10μl/孔加入孔內(nèi)，再按40μl/孔加入抗體工作液，加完后震蕩混勻，

3.溫育：蓋上封板膜，置37℃溫育60分鐘；

4.洗板：揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250μl，后甩去孔內(nèi)液體，以上步驟重復(fù)5次，最后在干凈吸水紙上拍干；

5.溫育：每孔加酶結(jié)合物50μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

6.洗板：小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌5次，方法同4.切記最后在干凈吸水紙上拍干。

7.加顯色劑：每孔加顯色液100μl，混勻，蓋上封板膜30℃避光顯色10分鐘。

8.加終止液：每孔加終止液50μl，使反應(yīng)終止，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。

3.3.2 實驗操作注意事項

（1）加樣位置

加樣位置至關(guān)重要，因為實驗中涉及陽性血清、陰性血清、被檢血清三種，如果稍不留意容易混淆，一旦加樣的位置錯誤，容易導(dǎo)致陰性對照及陽性對照的成立條件無法形成，從而導(dǎo)致實驗失敗。

（2）移液槍頭的及時更換

移液槍頭必須要保證每取一份血清就更換一次，如果交叉使用，容易造成樣品污染，繼而影響實驗結(jié)果。

（3）孵育的條件及時間

孵育的時候應(yīng)注意避光，而且溫度要控制在37℃，因為酶的活性在37℃時活性最高，溫度過高或者過低都會影響其活性，所以溫度控制在37℃使酶結(jié)合物跟底物能充分反應(yīng)。其次，溫育時間也很重要，溫育時間若人為延長，會導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，不能完全清洗干凈，使試驗結(jié)果不準(zhǔn)確。所以，在實驗過程中，應(yīng)按照說明嚴(yán)格控制操作溫度和時間。

（4）洗板

配制洗滌液時應(yīng)使用新鮮無污染的蒸餾水或去離子水，現(xiàn)配現(xiàn)用。洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，每次洗滌都要充分，盡量避免漏液、溢液現(xiàn)象。

（5）顯色

顯色是無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)，反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。加入底物后應(yīng)立即避光顯色。顯色劑盡量在臨使用前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。若底物呈現(xiàn)顏色變化則堅決不能再用。

（四）結(jié)果判定

試驗成立的條件：

陰性對照OD值>0.5，同時陽性對照（P）阻斷率>50%

計算方法：

PI（阻斷率）={1-（樣品OD值÷陰性對照OD均值）}×100%

陰陽性判斷：

PI（阻斷率）>45%則判斷為陽性；PI≤45%則判斷為陰性。

4 結(jié)語

從實驗結(jié)果看：1.陽性和陰性對照條件成立，實驗有效；2.圖表中陽性代表經(jīng)過口蹄疫A型抗體免疫的牛血清中含有抗體，陰性則代表沒有檢出其含有口蹄疫A型抗體，免疫綜合率占50%；3.樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差都控制在10%以內(nèi)，不但從側(cè)面的反映出酶聯(lián)免疫試劑盒生產(chǎn)技術(shù)的成熟，也說明了在試劑因素、樣本因素以及人為操作因素操作上嚴(yán)格控制的話實驗結(jié)果會相對更理想。綜上所述，獸醫(yī)實驗室抗體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響著動物疫病防控的實踐，通過在實驗過程中加強實驗室檢測技術(shù)的應(yīng)用能夠最大程度上降低試劑因素、樣本因素以及人為操作因素對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，從而為當(dāng)前獸醫(yī)實驗室的動物疫病防控工作提供依據(jù)。

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