分子生物學(xué)技術(shù)在微生物群落研究中的應(yīng)用

劉華健

摘 要：微生物群落有個(gè)體小，種類多，不易觀察等特點(diǎn)，分子生物技術(shù)的興起彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法對(duì)于微生物群落研究的不足，簡(jiǎn)單介紹了DGGE技術(shù)、T？RFLP技術(shù)、高通量測(cè)序等目前應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)，包括技術(shù)原理，研究過(guò)程，和優(yōu)缺點(diǎn)等。

關(guān)鍵詞：微生物群落;DGGE技術(shù);T-RFLP技術(shù);高通量測(cè)序技術(shù)

微生物數(shù)量大種類多，在生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法等很難對(duì)微生物群落的作出全面深入的研究，自PCR法發(fā)明后，基于分子生物學(xué)技術(shù)方法應(yīng)運(yùn)而生，在微生物群落的研究中正廣泛的應(yīng)用起來(lái)。

一、DGGE技術(shù)

DGGE（Denatured Gradient Gel Electrophoresis）技術(shù)，即變性梯度凝膠電泳技術(shù)，它最早是由Fischer和Lerman于1979年提出的，最初用于檢測(cè)DNA的點(diǎn)突變。1993年Muyzcr等人首次將DEEG技術(shù)運(yùn)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，并且發(fā)現(xiàn)此項(xiàng)技術(shù)對(duì)于微生物群落的種群差異和遺傳多樣性方面的研究具有很大的優(yōu)勢(shì)[1]。此電泳技術(shù)分離DNA的原理主要利用相同長(zhǎng)度的DNA片段由于其堿基組成不同，解鏈時(shí)需要的變性劑濃度不同，導(dǎo)致DNA鏈在由低到高濃度的聚丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)時(shí)，會(huì)在不同的濃度下變性而減慢移動(dòng)速度，從而把DNA鏈分離開(kāi)來(lái)。此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為微生物群落分子生態(tài)學(xué)的主要研究方法之一。

實(shí)驗(yàn)流程為，微生物DNA的提?。嚎捎肅TAB法或生物公司的DNA提取試劑盒在無(wú)菌工作臺(tái)上提取微生物DNA。目的基因擴(kuò)增：根據(jù)其所研究微生物的種類不同選取具有高度保守區(qū)的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，如原核微生物一般選取16S rDNA的V3、V4、V5等區(qū)域，真核微生物一般對(duì)其ITS和18S rDNA基因片段等進(jìn)行擴(kuò)增。電泳及電泳圖譜分析：電泳與瓊脂糖電泳相似，制膠時(shí)需要注意根據(jù)所擴(kuò)增的目的基因制備合適濃度的變性凝膠。跑完的凝膠經(jīng)過(guò)染色后形成可視條帶，可通過(guò)Quantity One等軟件來(lái)分析電泳條帶，來(lái)對(duì)微生物群落進(jìn)行聚類和相似性等分析。DGGE技術(shù)，具有分辨率高、操作簡(jiǎn)單迅速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但也有對(duì)環(huán)境微生物含量要求高、有些物種基因的不同拷貝中之間存在異質(zhì)性問(wèn)題等缺點(diǎn)[2]。

二、T-RFLP技術(shù)

T-RFLP（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)，是對(duì)人類遺傳學(xué)家1980年提出的PCR-RFLP技術(shù)的改良，使其更快速有效具有更高的分辨率，更容易操作分析，在微生物群落分析中有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[3]。T-RFLP技術(shù)主要技術(shù)原理是因不同物種基因序列存在差異，導(dǎo)致用限制性酶切后的基因片段長(zhǎng)度不同，熒光標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的限制性片段代表不同的細(xì)菌種類，從而達(dá)到對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性等進(jìn)行分析的目的。

T-RFLP的主要流程，先提取微生物群落的總DNA，用末端標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA（以細(xì)菌為例，真菌可擴(kuò)增26S rDNA等），然后選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增后的末端帶有熒光16S rDNA進(jìn)行酶切。酶切后的產(chǎn)物用DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行片段分離，末端帶有熒光標(biāo)記的片段被分離出來(lái)，因?yàn)槊恳环N菌末端帶有熒光標(biāo)記片段長(zhǎng)度不同，所以測(cè)序儀上的峰值圖上，每一個(gè)峰值代表著一個(gè)細(xì)菌。峰值曲線下的面積越大代表該菌種的數(shù)量越多。

T-RFLP技術(shù)有快速、高分辨率、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但其存在只能提供微生物的種類和相對(duì)數(shù)量的信息的缺點(diǎn)[4]，所以現(xiàn)在對(duì)利用T-RFLP技術(shù)的應(yīng)用相對(duì)減少，但對(duì)于一些不需要嚴(yán)格定性分析的微生物群落調(diào)查中，T-RFLP技術(shù)仍然具有很大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。如2016年龍海等人，利用T-RFLP技術(shù)對(duì)深港兩地的工程土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了多樣性分析。發(fā)現(xiàn)香港段土壤大約有141屬，235種細(xì)菌，深圳段大約存在132屬，206種。其中香港段的特有種屬有32個(gè)，深圳段的特有種有3個(gè)[5]。

三、高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)也叫第二代測(cè)序技術(shù)，2005年Roche公司首先推出了焦磷酸測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了超高通量的基因測(cè)序，開(kāi)創(chuàng)了第二代測(cè)序的先河[6]。隨后Illmina公司和ABI公司也相繼推出了自己的Solexa和SOLiD技術(shù)，目前Roche公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)面臨淘汰，Illmina公司的Hiseq測(cè)序技術(shù)應(yīng)用廣泛，是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器。

Illmina公司的Hiseq測(cè)序技術(shù)采用邊合成邊測(cè)序的原理，DNA在復(fù)制時(shí)加入帶有熒光標(biāo)記的ddNTP無(wú)3′羥基，在合成中不能形成磷酸二酯鍵而終止合成反應(yīng)，根據(jù)4種熒光標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）顯示的熒光顏色不同和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，就能知曉所測(cè)片段的DNA序列。

高通量實(shí)驗(yàn)流程易操作，關(guān)于微生物總DNA的提取，和目的片段（16S rDNA、ITS等）PCR的擴(kuò)增，與前面所介紹的分子生物學(xué)技術(shù)步驟基本相同。PCR擴(kuò)增盡量選取低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增以免造成誤差。PCR擴(kuò)增后的待測(cè)序列用超聲波打斷成200-500的小片段DNA，在其3′端加A堿基，構(gòu)建DNA文庫(kù)，然后把構(gòu)建好的DNA文庫(kù)放入測(cè)序機(jī)器的測(cè)序流動(dòng)槽中，利用橋式PCR擴(kuò)增上樣DNA鏈，最后邊合成邊測(cè)序，利用相機(jī)拍攝的熒光顏色通過(guò)電腦程序得出所測(cè)序的DNA序列。測(cè)序的序列還要經(jīng)過(guò)拼接優(yōu)化，并與基因庫(kù)里的基因做比對(duì)，確認(rèn)所對(duì)應(yīng)的物種信息后才能做后續(xù)微生物群落分析。高通量測(cè)序技術(shù)具有效率高、準(zhǔn)確性高、可定量、測(cè)序通量大等特點(diǎn)。但也存在實(shí)驗(yàn)耗資貴，數(shù)據(jù)量龐大帶來(lái)的后續(xù)分析困難等問(wèn)題[7]。

微生物群落的研究中，在要求不高的情況下傳統(tǒng)的分析技術(shù)還有其很大的實(shí)用性，但對(duì)于微生物群落大量更深層次的研究中分子生物學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生具有劃時(shí)代的意義，目前多種技術(shù)的應(yīng)用和伴隨科技的發(fā)展更多的實(shí)用技術(shù)的產(chǎn)生（如，第三代測(cè)序技術(shù)）會(huì)使研究者對(duì)微生物群落的調(diào)查研究更深入更方便快捷。

參考文獻(xiàn)：

[1]張明月.DGGE用于兩種不同類型生境的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2012

[2]劉瑩.夏季北冰洋海域微微型和微型浮游生物的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2013

[3]王孟孟，楊兆光， 李海普等.陸地環(huán)境微生物多樣性研究技術(shù)的進(jìn)展[J]. 化學(xué)工程與裝備，2018，（8）：277—278.

[4]賈俊濤，宋林生， 李筠等.T？RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J]. 海洋科學(xué)，2004，28（3）：64—68.

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[6]王興春，楊致榮，王敏等.高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2012，32（1）：109—114.

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