細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠法在藥品中的應(yīng)用及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

劉小靜　王亞婷

摘 要：本文主要介紹細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠法的原理、操作及注意事項(xiàng)，因凝膠法實(shí)驗(yàn)過(guò)程時(shí)間短，消耗樣品量少，且使用設(shè)備簡(jiǎn)單，費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，并作為《中國(guó)藥典》“仲裁”檢查方法，廣泛用于注射劑藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素;凝膠法;注射劑藥品

細(xì)菌內(nèi)毒素作為外源性致熱原的內(nèi)毒素能激活中性粒細(xì)胞等，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁個(gè)層上的特有結(jié)構(gòu)，會(huì)使中性粒細(xì)胞釋放一種叫內(nèi)源性熱原質(zhì)的物質(zhì)，其在體溫調(diào)節(jié)的中樞會(huì)引起發(fā)熱反應(yīng)。當(dāng)內(nèi)毒素經(jīng)消化道進(jìn)入人體不會(huì)產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素經(jīng)注射液等方式進(jìn)入血液時(shí)則引起癥狀不同的疾病。因此，藥品安全性檢驗(yàn)一個(gè)重要項(xiàng)目就是藥品注射劑中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。美國(guó)科學(xué)家Levin和Bang1968年建立鱟試驗(yàn)法來(lái)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素，美國(guó)FDA于1973年制定的規(guī)則指出“鱟試劑是一種檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏指示劑。”

1 鱟試劑的特性及與內(nèi)毒素產(chǎn)生反應(yīng)的作用機(jī)理

鱟試劑是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中最重要的試劑。它是鱟科血細(xì)胞（變形細(xì)胞）裂解液的凍干產(chǎn)物。鱟的血液中只有一種類(lèi)型的血細(xì)胞參與循環(huán)就是被稱(chēng)為變形細(xì)胞。目前制備細(xì)胞鱟試劑一種是東方鱟，另一種是美洲鱟。研究鱟試劑作用機(jī)理表明，細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中鱟血細(xì)胞溶解物，產(chǎn)生一系列的凝集酶反應(yīng)，形成凝固蛋白凝膠。判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量能否在規(guī)定范圍，可通過(guò)用鱟試劑檢測(cè)，或者是量化革蘭陰性菌所產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素。

2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

2.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌株由大腸桿菌提煉精制而成，是用來(lái)檢查，校準(zhǔn)，仲裁鱟試劑靈敏度、細(xì)菌內(nèi)毒素濃度測(cè)定，干擾測(cè)試和測(cè)試方案中供試品陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備和光度測(cè)定方法的可靠性測(cè)試、凝膠檢查鱟試劑試驗(yàn)敏感性。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌內(nèi)毒素校準(zhǔn)的參照標(biāo)準(zhǔn)，單位為內(nèi)毒素（EU），1EU等于1國(guó)際單位內(nèi)毒素（IU）。

2.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

玻璃器皿在酪酸洗液、其他熱源性滅活劑、或清洗劑將充分浸泡，控干洗液后用蒸餾水3遍以上的沖洗，放入干燥箱，在250℃干烤30min以上，用以除掉可能性存在外源性?xún)?nèi)毒素干擾。如果用塑料的器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器具。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素采樣標(biāo)準(zhǔn)品與專(zhuān)門(mén)的檢查水在渦流攪拌器中混合溶解15min，稀釋后測(cè)定鱟試劑的靈敏度值（λc）。每一批新批次鱟試劑全部需嚴(yán)格采用靈敏度試驗(yàn)。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

將8支鱟試劑分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用0.1mL水溶解。按最大稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液0.1mL加入2支，作為供試品溶液管，2支加入含內(nèi)毒素濃度為2λ對(duì)照溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照管，2支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL作為陽(yáng)性對(duì)照管，2支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1mL作為陰性對(duì)照管。試管混勻封口置于37℃±1℃恒溫器中保溫60分鐘±2分鐘，從恒溫器中慢慢取出，極緩的倒轉(zhuǎn)180°，若未形成凝膠，或者形成凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形體從管壁下滑脫落為陰性;管內(nèi)出現(xiàn)凝膠并且凝膠不變形、如果不從管壁下滑脫落即為陽(yáng)性。拿取或者保溫試管時(shí)要避免振動(dòng)，以免出現(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果。

2.5實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

準(zhǔn)備工作：肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。應(yīng)在清潔環(huán)境中進(jìn)行操作，取樣時(shí)防止混入氣體，并防止微生物污染移液管。

3 干擾試驗(yàn)的必要性

鱟試劑凝聚反應(yīng)是一種二價(jià)陽(yáng)離子酶反應(yīng)體系，有許多干擾反應(yīng)的物質(zhì)會(huì)干擾凝膠的形成。在新樣品測(cè)定中，必須首先進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)，確定是否存在干擾樣品出現(xiàn)縮合反應(yīng)的因素。為了保證所選處理方案能夠在不滅活內(nèi)毒素情況下有效消除干擾，采用預(yù)先添加的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再處理液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

4 可能會(huì)出現(xiàn)的異常結(jié)果及其原因和解決方法

4.1 造成呈假陰性的可能原因及解決方法

原因可能是：①內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)中存在的一些問(wèn)題，如滴度標(biāo)注不準(zhǔn)確，過(guò)期或貯存不當(dāng)導(dǎo)致失效，稀釋誤差或稀釋振蕩不夠，對(duì)照管沒(méi)有達(dá)到2λ陽(yáng)性?xún)?nèi)毒素濃度;②問(wèn)題出在鱟試劑。例如，過(guò)期失效，振蕩不當(dāng)，靈敏度標(biāo)注不準(zhǔn)確，會(huì)產(chǎn)生氣泡，鱟試劑酶蛋白變性，鱟試劑破壞;③溫控器溫度不符合要求或保溫時(shí)間不夠。

解決辦法包括：規(guī)范內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)的審查和鱟試劑在保質(zhì)期正確儲(chǔ)存和使用的敏感性;內(nèi)毒素稀釋?xiě)?yīng)準(zhǔn)確，確保PC管添加2λ內(nèi)毒素;當(dāng)使用可溶解的鱟試劑時(shí)，沿著管壁慢慢加水，讓混合器振蕩30s。避免劇烈振動(dòng)產(chǎn)生氣泡，確保恒溫器溫度和保溫時(shí)間正確。

4.2 造成假陽(yáng)性的可能原因及解決方法

原因可能包括：實(shí)驗(yàn)設(shè)備受到污染，經(jīng)熱原、外源性?xún)?nèi)毒素或微生物污染不能完全滅活;試驗(yàn)中由于誤操作造成的內(nèi)毒素污染;BET水不符合要求，內(nèi)毒素超標(biāo)，培養(yǎng)溫度不正確等。解決方案包括：按照2015年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行處理;選擇合格的BET水，確保正確的培養(yǎng)溫度、時(shí)間和操作。

總而言之，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法已被列入許多國(guó)家藥典。方法學(xué)研究表明，用細(xì)菌內(nèi)毒素法取代家兔熱原法的藥物種類(lèi)較多，因?yàn)樗燃彝脽嵩ǜ珳?zhǔn)、快速、簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)、容易推廣等諸多優(yōu)點(diǎn)。

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