金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立研究

祖恩凡 趙晨晨 張凌霄 錢晶晶

摘要：以金銀花脫毒苗為試材，研究了外植體、培養(yǎng)基對金銀花疏松愈傷組織的誘導(dǎo)以及懸浮培養(yǎng)液中激素種類及其濃度和初始接種量對金銀花懸浮細(xì)胞生長的影響。結(jié)果表明：幼葉最易誘導(dǎo)愈傷組織;細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最佳培養(yǎng)液為：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 m01L;最佳初始接種量為60g/L。

關(guān)鍵詞：金銀花;疏松愈傷組織;細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物，有研究指出，金銀花含有大量化學(xué)成分，如揮發(fā)油中多有不飽和烯萜類和芳香醇類物質(zhì)、有機(jī)酸類、黃酮類和皂苷等。金銀花含有大量的化學(xué)成分，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能，用于治療溫病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、肺炎、丹毒、蜂窩狀組織炎和痢疾等多種疾病，為臨床最常用中藥之一。金銀花作為食品、飲品應(yīng)用廣泛，且市場前景廣闊。近年來，大部分提取物都是采用金銀花植物提取，若采用人工栽培方式培育，生長周期相對較長;而植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)具有不受環(huán)境和季節(jié)影響、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點。

1材料與方法

1.1試驗材料

外植體來源于安徽科技學(xué)院種植基地，采集健壯的無病蟲害金銀花的新生嫩莖，去除葉片作為外植體，用流水沖洗10min后備用。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒。放入外植體，用無菌水沖洗3～4次。將外植體放入超凈工作臺中，用無菌水沖洗3次，分別用雙氧水中浸泡消毒7min，再用無菌水沖洗5次，最后將沖洗好的材料放于濾紙上備用。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)。將莖切成小段，處理葉片時則在葉脈處輕輕劃上3～4道傷口，而后將截面朝向培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基均為：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.2mg/L。l周后，比較不同外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織性狀及生長狀況。試驗中不同外植體接種為一組試驗，每組做3個重復(fù)，取平均數(shù)繪制生長曲線。

1.2.3誘導(dǎo)率與褐化率的統(tǒng)計。誘導(dǎo)率（%）=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體塊數(shù)×100;褐化率（%）=褐化愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100。

1.2.4細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。繼代2次后，選擇生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織塊，用鑷子夾碎或用小刀分割得到愈傷組織碎塊，轉(zhuǎn)移到裝有MS液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，置于搖床內(nèi)110r/min，26～C振蕩培養(yǎng)，每7d繼代1次，繼代時培養(yǎng)物用200目的滅菌細(xì)胞篩過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)和殘渣，得到一定體積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。試驗過程中采用不同激素（6 BA、NAA和2，4-D）及不同濃度的組合（表2）比較不同激素及濃度處理對金銀花懸浮細(xì)胞生長的影響。建立金銀花細(xì)胞懸浮體系最優(yōu)培養(yǎng)體系。試驗中不同激素組合為一組試驗，每組做3個重復(fù)，取平均數(shù)繪制生長曲線。

1.2.5接種量對金銀花懸浮細(xì)胞生長的影響。選取起始接種量4，6，8g，L，研究不同接種量對金銀花懸浮細(xì)胞生長的影響。每3d觀察生長情況，并分別取得細(xì)胞稱鮮重。試驗中每個接種量為一組實驗，每組做3個重復(fù)，取平均數(shù)繪制生長曲線。

2結(jié)果與分析

2.1外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1數(shù)據(jù)中顯示，幼葉誘導(dǎo)形成的愈傷組織較為疏松，生長較快，褐化率較低;老葉誘導(dǎo)形成的愈傷組織也較為疏松，褐化率低，但生長緩慢;而嫩莖誘導(dǎo)形成的愈傷組織較為堅硬，褐化率高。因此該試驗選擇金銀花的幼葉作為外植體。

2.2激素對金銀花細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)的影響

由表2可知，不同的激素種類和不同濃度配比對金銀花愈傷組織的誘導(dǎo)有明顯的影響。6-BA含量越高誘導(dǎo)的細(xì)胞懸浮液顏色越綠，且分散性不好，不適合細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。而2，4-D含量較高的組合中誘導(dǎo)的培養(yǎng)液顏色為黃色，分散性較好。

試驗顯示，MS+6-BA 0.6 mg，L+NAA 0.5 mg/L+0.2 mg，L是金銀花細(xì)胞懸浮適合的激素組合。

2.3金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采用的液體培養(yǎng)基激素配比與誘導(dǎo)愈傷的固體培養(yǎng)基相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長經(jīng)歷了4個階段：遲滯期、快速生長期、平衡期和衰亡期，表現(xiàn)為典型的S形生長曲線。液體懸浮培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長周期為15d（圖1）。

2.4初始接種量對金銀花懸浮細(xì)胞生長的影響

初始接種量對金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響，初始接種量按每瓶（25mL培養(yǎng)液）接種鮮重1、1.5、2g的愈傷組織，接種于液體培養(yǎng)基中，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為40、60、80g/L。

圖1顯示，接種量較低時細(xì)胞的生長較為緩慢，接種量高時細(xì)胞出現(xiàn)了褐化死亡，培養(yǎng)液變?yōu)楹稚?。而接種量為低處理組的生長期最長，細(xì)胞生長量最大。

初始接種量對細(xì)胞的增殖有明顯的影響，初始接種量達(dá)到一定的值后細(xì)胞才能增殖，這是由于植物細(xì)胞的群集效應(yīng)而引起的;另一方面，接種量過高則細(xì)胞密度大，導(dǎo)致培養(yǎng)液中的養(yǎng)分很快被耗盡，同時容易積累有害物質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老，細(xì)胞的生長量隨即逐漸減少。該研究結(jié)果表明，60g/L為金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最適初始接種量。

3結(jié)論與討論

金銀花為我國傳統(tǒng)中藥材，其歷史悠久。目前，對于金銀花無性繁殖的文章中涉及組織培養(yǎng)的研究較多，未查閱到金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)。本試驗采用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過外植體選擇、激素選擇和起始接種量的研究初步建立起了金銀花細(xì)胞懸浮體系。試驗中，最適外植體為金銀花幼葉;最適懸浮培液為：MS+6-BA 0.6 mg/+NAA 0.5 mg/L+0.2mg/L，最佳起始接種量為60gL。

通過本次試驗建立起金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系并為今后的金銀花細(xì)胞產(chǎn)物提取打下基礎(chǔ)。