根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

楊靜

摘 ? 要：在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的進(jìn)展中，因根癌農(nóng)桿菌具有轉(zhuǎn)入的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、外源基因表達(dá)比較穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、技術(shù)儀器要求低等優(yōu)勢(shì)，成為了目前應(yīng)用較為廣泛的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物的發(fā)展?fàn)顩r、影響因素和提高轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了綜述，以期為提高單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化技術(shù)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：根癌農(nóng)桿菌;單子葉植物;遺傳轉(zhuǎn)化;研究進(jìn)展

將農(nóng)桿菌作為載體成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草的試驗(yàn)發(fā)生在1983年，其后的30多年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在雙子葉植物的研究中得到了長(zhǎng)足發(fā)展。之后，關(guān)于單子葉植物在這方面的研究卻比較少，因?yàn)檗r(nóng)桿菌寄主范圍局限于雙子葉植物和一些裸子植物。單子葉植物被認(rèn)為不能作為農(nóng)桿菌的宿主，所以難以被轉(zhuǎn)化。因此最初人們關(guān)于單子葉植物通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的研究很少，而多是采用PEG法、基因槍法及電激法等。

1 ? 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究進(jìn)展

1.1 ? 水稻

水稻作為單子葉植物研究的模式植物，關(guān)于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究開(kāi)始得比較早。水稻的遺傳轉(zhuǎn)化研究從完全否定其可行性，到可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從低頻率轉(zhuǎn)化到高頻率，經(jīng)過(guò)幾十年的研究發(fā)展，已經(jīng)具備了相當(dāng)?shù)睦碚摶A(chǔ)和研究成果，實(shí)現(xiàn)了許多優(yōu)質(zhì)的外源基因?qū)λ镜倪z傳轉(zhuǎn)化[1]。

李寶健證明了水稻是可以通過(guò)農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的，并獲得了轉(zhuǎn)基因的水稻，雖然其轉(zhuǎn)化頻率很低，卻是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物的一大突破。這之后，Hiei證明了水稻是可以被有效侵染的，他不僅利用胚性愈傷組織作外植體，還將粳稻的轉(zhuǎn)化頻率提高到28.3%，并建立了水稻的遺傳轉(zhuǎn)化體系。王春萍等[2]將ThIPK2基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法插入到秈稻科恢675中，經(jīng)驗(yàn)證后，通過(guò)該試驗(yàn)結(jié)果完善了優(yōu)良的遺傳轉(zhuǎn)化體系。張燕紅等[3]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將SiPEBP基因轉(zhuǎn)入到秋田小町、新稻 21 號(hào)以及08GY30-5-4這3個(gè)新疆品種水稻中，試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)品種的抗性愈傷率皆達(dá)到了40%以上。

1.2 ? 玉米

玉米作為三大糧食作物之一，是作為單子葉植物研究的重要對(duì)象。1996年，Ishida等[4]選用玉米自交系A(chǔ)188幼胚作為受體的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，獲得了世界上第一株用該方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米，從而證實(shí)玉米是能夠被轉(zhuǎn)化的，為玉米的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

邢小龍等[5]將 GUS作為目的基因，以玉米雜交種“鄭單958”為材料，以Bar作篩選標(biāo)記，試驗(yàn)結(jié)果表明，在侵染濃度0.6、侵染時(shí)間2 h、真空處理時(shí)間10 min的條件下，“鄭單958”作為受體能有效提高轉(zhuǎn)化效率。李曉麗等[6]將大豆鐵蛋白ferritin作為目的基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功地將其目的基因轉(zhuǎn)入了玉米319莖尖組織中，從而使外源基因能夠轉(zhuǎn)入玉米之中，使該玉米具有了除草的抗性。

1.3 ? 小麥

小麥?zhǔn)侨蠊任镏唬彩侨祟惖闹魇持?，將其磨成面粉可以制作各種食品，也可用于制作酒類，還可制成生物質(zhì)燃料。對(duì)小麥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，對(duì)提高其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。

世界上第一株用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的小麥誕生于1997年。Cheng等[7]利用35S啟動(dòng)子、HSP70內(nèi)含子組成農(nóng)桿菌載體，將其插入到小麥中，最終轉(zhuǎn)化率為4.3%，其轉(zhuǎn)化效率還比較低，但隨著研究深入以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的研究也日趨完善。

鄧萬(wàn)銀等將致瘤農(nóng)桿菌插入到處于抽穗期小麥的葉鞘基部和穗莖中，經(jīng)過(guò)21 d，小麥出現(xiàn)瘤狀組織，該瘤狀組織中有冠痰堿，并且在試驗(yàn)中加入乙酸丁香酮，可以增大瘤狀組織和提高出現(xiàn)頻率。Hess等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將農(nóng)桿菌注入到處于花期小麥穗的小穗中，并用收獲的種子進(jìn)行后續(xù)萌發(fā)試驗(yàn)，得到了卡那霉素抗性植株，該試驗(yàn)證實(shí)了nptⅡ基因可以整合到小麥中并得到穩(wěn)定的遺傳。Xu等用酚類化合物對(duì)農(nóng)桿菌作預(yù)處理，然后再用處理過(guò)的農(nóng)桿菌侵染小麥的懸浮系細(xì)胞，得到了抗性愈傷組織，但數(shù)量較少，而且沒(méi)有再生植株。郭麗等[8]通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將小麥成熟胚作為受體，得到了再生植株，其中3株經(jīng)過(guò)報(bào)告基因GUS的PCR檢測(cè)，均為陽(yáng)性，并建立了相應(yīng)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系。

2 ? 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的因素

2.1 ? Vir基因誘導(dǎo)物

農(nóng)桿菌感染雙子葉植物時(shí)會(huì)發(fā)出信號(hào)，植物的受傷部位會(huì)產(chǎn)生乙酰丁香酮等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)Vir基因，從而促進(jìn)T-DNA基因向雙子葉植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而單子葉植物則不同，在受到外部傷害時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)木質(zhì)化和硬化現(xiàn)象，無(wú)法產(chǎn)生乙酰丁香酮等物質(zhì)，因此許多單子葉植物并不是農(nóng)桿菌的有效宿主。

水稻得以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化，一個(gè)很關(guān)鍵的原因是在轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入了100 μmol/L的乙酰丁香酮，使得農(nóng)桿菌更加容易侵染水稻的愈傷組織[9]。Chan等[10]將馬鈴薯種的細(xì)胞懸浮液添加到培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，也起到了提高轉(zhuǎn)化效率的作用，這是因?yàn)轳R鈴薯的細(xì)胞懸浮液中含有大量的酚類化合物，有助于激活Vir基因，幫助轉(zhuǎn)化。

2.2 ? 農(nóng)桿菌菌株及載體系統(tǒng)

在將目的基因植入到受體過(guò)程中，農(nóng)桿菌菌株的選擇以及高效的載體系統(tǒng)至關(guān)重要。Hiei等[11]用了雙元載體的方法，將菌株A281的Ti質(zhì)粒上的VirBEG基因復(fù)制到雙元載體，從而造就了超雙元載體，最后結(jié)果顯示水稻達(dá)到了高頻率轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物的試驗(yàn)中，常用的超毒力菌株通常有EHA101、EHA105以及AGL-1等。劉巧泉等[12]在之后的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于攜帶質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌，EHA105的敏感度要明顯高于LBA4404和AGL-1，是轉(zhuǎn)化水稻十分高效的菌株。

2.3 ? 篩選劑的選擇

卡那霉素可作為篩選劑，但是在轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選中作用不明顯，而且篩選后的愈傷組織很多不能再生出綠色植株。Toriyama等[13]選擇氨基糖苷類抗生素——G418作為篩選劑，該抗生素在篩選作用上更為高效，且不會(huì)像卡那霉素一樣使經(jīng)過(guò)篩選的愈傷組織失去再生綠色植株的能力。霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）也是常用的篩選劑，它對(duì)氨基糖苷類抗生素——潮霉素B（Hyg）有著明顯的抗性表達(dá)，能更加清楚地分辨未轉(zhuǎn)化與已轉(zhuǎn)化的組織，且不會(huì)導(dǎo)致白化、不育等現(xiàn)象的發(fā)生。

2.4 ? 單子葉植物的外植體和基因

在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)單子葉植物的轉(zhuǎn)化中，受體本身的狀態(tài)和遺傳背景也是影響轉(zhuǎn)化的因素。雖然同為單子葉植物，但是不同的類別和品種在基因組合、生長(zhǎng)狀態(tài)、生存環(huán)境、生理代謝等方面必然也有所不同，不同的細(xì)胞甚至相同細(xì)胞在不同的狀態(tài)下對(duì)根癌農(nóng)桿菌的敏感性是不同的，同樣，農(nóng)桿菌對(duì)它們的感染性也存在著差異。植物受傷時(shí)會(huì)分泌出酚類物質(zhì)，該物質(zhì)的主要功能是激活農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的毒性區(qū)，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，因此，外植體的選擇對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物有著很大的影響，選擇合適的外植體，有助于提高轉(zhuǎn)化效率。

易自力[14]的研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌對(duì)不同品種水稻的敏感性是不同的，如粳稻品種臺(tái)北309和稻品種特青，對(duì)3種菌株的瞬時(shí)表達(dá)率平均值分別為55.5%、34.8%，存在顯著差別。葉興國(guó)等[15]在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的試驗(yàn)中，對(duì)35個(gè)小麥品種作了比較，其中的兩個(gè)品種對(duì)農(nóng)桿菌有較強(qiáng)的敏感性，分別是新春9號(hào)和PM97034。

3 ? 提高轉(zhuǎn)化效率的對(duì)策

3.1 ? 添加表面活性劑

表面活性劑可以提高細(xì)胞膜的通透性，便于農(nóng)桿菌對(duì)受體的侵染，加快T-DNA基因由農(nóng)桿菌向受體的轉(zhuǎn)移速度，以提高轉(zhuǎn)化效率。表面活性劑在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物中的主要功能包括：一是其雙親結(jié)構(gòu)對(duì)有機(jī)物有著較強(qiáng)的吸引力;二是其分子在濃度較低的情況下可以吸附于兩相界面，從而緩解界面張力，讓分散的系統(tǒng)逐漸穩(wěn)定。表面活性劑可分為離子型、非離子型兩類，其中非離子型的表面活性劑對(duì)受體造成的傷害小，且毒性弱，故應(yīng)用較為普遍。

Cheng在農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)中添加了表面活性劑，結(jié)果表明，添加一定濃度的Silwet和PluronicF-68的表面活性劑有助于提高農(nóng)桿菌的侵染效果和促進(jìn)外源基因的轉(zhuǎn)移。但相對(duì)地，在培養(yǎng)液中加入濃度很低的Tween20、TritonX表面活性劑則有反作用，會(huì)為害小麥的愈傷組織。Chhabra等[16]在轉(zhuǎn)化小麥的研究中，加入了0.2% Tween20的表面活性劑處理農(nóng)桿菌侵染液，從而提高了小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率，但表面活性劑一旦高于該濃度，轉(zhuǎn)化植株的GUS瞬時(shí)表達(dá)率就會(huì)急劇下降。

3.2 ? 添加抗氧化劑

在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物的試驗(yàn)中，受體細(xì)胞在被侵染的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生逆境環(huán)境，繼而產(chǎn)生過(guò)氧化物，使受體細(xì)胞被氧化，導(dǎo)致愈傷組織在共培養(yǎng)階段褐化，阻礙組織分化?？寡趸锟梢匀コ?xì)胞內(nèi)的活性氧成分，起到避免細(xì)胞被氧化的作用，減少共培養(yǎng)階段愈傷組織的褐化現(xiàn)象，促進(jìn)農(nóng)桿菌對(duì)受體的侵染，加快轉(zhuǎn)化。

于惠敏等[17]在轉(zhuǎn)化濟(jì)南177小麥試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過(guò)程中添加抗氧化劑二硫蘇糖醇（DDT）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），有助于轉(zhuǎn)化，當(dāng)DTT的濃度在0.1%～0.15%，PVPP含量達(dá)到1.0%時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，且DTT提高轉(zhuǎn)化效率的作用要明顯高于PVPP。除此之外，AgNO3、半胱氨酸（Cys）、抗壞血酸（Vc）等抗氧化劑都能起到保護(hù)細(xì)胞不被氧化的作用，其中AgNO3的應(yīng)用范圍較廣，對(duì)組織褐化有明顯的阻礙作用。

3.3 ? 整株轉(zhuǎn)化

“整株培養(yǎng)”技術(shù)是將外源基因以裸露DNA的形式直接或通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入到完整的植株中，完成基因的轉(zhuǎn)移。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物的試驗(yàn)中，組織培養(yǎng)的步驟繁多，而且十分耗費(fèi)時(shí)間，已轉(zhuǎn)化的組織還容易發(fā)生體細(xì)胞克隆變異（somaclonalvari-ations）和嵌合體（chimera）等現(xiàn)象。“整株轉(zhuǎn)化”可以減少組織培養(yǎng)的步驟。“整株培養(yǎng)”技術(shù)在擬南芥研究上取得了巨大的成就。在水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，幼胚和幼穗經(jīng)過(guò)預(yù)培育得到的愈傷組織可作為轉(zhuǎn)化對(duì)象，不同的是，幼胚的預(yù)培育時(shí)間在3～5 d，而成熟胚盾片的預(yù)培育時(shí)間卻長(zhǎng)達(dá)30～50 d，使用幼胚培育可大大縮短試驗(yàn)時(shí)間。

4 ? 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的常年努力，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究從無(wú)到有、由淺入深、由點(diǎn)及面，研究體系、研究方法逐漸豐富，在許多領(lǐng)域取得了豐碩的成果，改良了許多單子葉植物的基因，提高了水稻、小麥、玉米的品質(zhì)和產(chǎn)量。但與雙子葉植物的研究相比，還存在著較大的差距，如可轉(zhuǎn)化的種類有限、轉(zhuǎn)化效率不高等，有待進(jìn)一步深入。此外，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化在實(shí)踐應(yīng)用上也還不夠廣泛，轉(zhuǎn)基因植物的推廣，對(duì)種植業(yè)、畜牧業(yè)甚至工業(yè)方面的發(fā)展都有十分重要的意義，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和推廣，其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益都會(huì)日趨顯現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 吳振映，柳絮，王文英，等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)cry2A *抗蟲基因水稻的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011（5）：1-3.

[ 2 ] 王春萍，謝樹(shù)章，蔣曉英，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻科恢675快速遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（1）：1-5.

[ 3 ] 張燕紅，趙志強(qiáng)，吳澤新，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51（8）：1-3.

[ 4 ] Ishida Y，Saito H，Ohta S，et al. High efficiency transformation ofm aize（Zea mays L.） mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Nat Biotechnol，1996，14（6）：745-750.

[ 5 ] 邢小龍，常紀(jì)蘋，付忠軍，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)GUS基因轉(zhuǎn)化玉米芽尖生長(zhǎng)點(diǎn)的研究[J].植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（4）：1-3.

[ 6 ] 李曉麗，王建軍，崔瑞潔，等.大豆鐵蛋白 Gm Ferritin在玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，39（2）：263-268.

[ 7 ] Cheng M，F(xiàn)ry JE，Pang S，et al. Genetic transform ation ofwheatm ediated by Agrobacteriumtum efaciens[J]. PlantPhysiol，1997，115（3）：971-980.

[ 8 ] 郭麗，谷俊濤，龍素霞，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥成熟胚的遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（增刊）：54-57.

[ 9 ] Duan Xiao-lan，Li Xiao-gang.Transgenic rice plants har-boring an introduced potato proteinase inhibitorⅡ gene areinsect resistant[J].Nature Biotechnology，1996（14）：494-498.

[ 10 ] Chan MT，Lee TM，Chang HH.Transformation of indicarice?（Oryzasativa L.）mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].?Plant Cell Physiol，1992（33）：577-583.

[ 11 ] Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al.Efficient transformation ofrice（Oryzasativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence?analysis of theboundaries of the T-DNA[J].Plant J，1994?（6）：271-282.

[ 12 ] 劉巧泉，張景六，王宗陽(yáng)，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高? 效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報(bào)，1998，24（3）：259-? 271.

[ 13 ] Toriyama K，Arimoto Y，Uchimiya H，et al .Transgenic rice? plants after direct gene transfer into protoplasts[J].Bio? Technol，1988（6）：1072-1074.

[ 14 ] 易自力，曹守云，王力，等.提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的? 研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2001，28（4）：352-358.

[ 15 ] 葉興國(guó)，王艷麗，康樂(lè)，等.農(nóng)桿菌敏感小麥基因型的篩? 選及其轉(zhuǎn)化[J].作物學(xué)報(bào)，2005，31（12）：1552-1556.

[ 16 ] Chhabra G，Chaudhary D，Sainger M ，et al. Genetic transform? ation of Indian isolate of Lemna minor mediated by A-?grobacterium tumefaciens and recovery of transgenic?plants[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants，? 2011，17（2）：129-136.

[ 17 ] 于惠敏，夏光敏，侯丙凱.提高農(nóng)? ?桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的幾? ?個(gè)因素[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)理學(xué)版，? ?2005，40（6）：120-124.

（收稿日期：2019-09-30）