小粒性菌核病菌侵染桑椹表達(dá)譜分析＊

殷培峰 孫 驍 步顯勇 向玉勇 柴新義 蔡金鑫

1. 滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000； 2. 安徽盼盼食品有限公司，安徽 滁州 239000

果桑具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力，其果實(shí)味甜汁多，營養(yǎng)價(jià)值豐富，在我國栽植面積不斷擴(kuò)大，但桑椹菌核病的發(fā)生率也大幅度上升。桑椹菌核發(fā)病原因在于菌核萌發(fā)產(chǎn)生子實(shí)體釋放子囊抱子侵染花序，孢子萌發(fā)后在子房內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致桑椹失去食用價(jià)值[1]。感病后期，菌絲在各種因素誘導(dǎo)下逐步形成菌核，并以菌核形式在土中越冬，第2年3月下旬至4月上中旬，氣溫在20℃左右，濕度在85%以上菌核繼續(xù)萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，釋放孢子，繼續(xù)為害[2]。桑椹菌核病病原菌多樣，以桑實(shí)杯盤菌(Ciboria shiraiana)、肉阜狀杯盤菌(Ciboria carunculoides)、核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)為主[3]，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，Scleromitrula sp.和Synciboria ningpoensis也被報(bào)道對(duì)桑花序具有侵染能力，導(dǎo)致桑椹發(fā)病[4-5]。菌核病致病性在其它農(nóng)作物如油菜報(bào)道較多，致病菌核盤菌菌絲代謝產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)和草酸(Oxalic acid)是關(guān)鍵致病因子，另外，果膠酶(Pectinase)、膠質(zhì)酶(Cutinase enzyme)、幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和一些胞外酶(Ectoenzyme)等也在致病過程中發(fā)揮了重要作用，但在桑椹菌核病病原菌侵染過程中的主要致病基因報(bào)道較少。

現(xiàn)階段，對(duì)桑椹菌核病防治主要通過噴灑抗真菌類農(nóng)藥[6]，但易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。為進(jìn)行生物防治，減少農(nóng)藥使用[7]，探究病原菌致病相關(guān)基因種類及數(shù)量，及這些基因參與過程代謝途徑[8]，是菌核病防治工作研究的重點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)可從整體水平上獲得所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達(dá)信息，已經(jīng)被越來越廣泛地應(yīng)用于各類致病菌的致病機(jī)理研究。本研究對(duì)小粒性菌核病(mulberry sorosus parvulling sclerote disease)病原菌感病初期轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)這些基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得致病基因種類數(shù)量，基因參與主要代謝通路，為通過基因工程對(duì)菌核病進(jìn)行防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料為滁州學(xué)院果桑種植基地果?！按?0”。人工接種收集的小粒性菌核病孢子，采集第3天發(fā)病病果，用無菌水沖洗，剔除外部桑椹果肉，獲取病原菌菌絲，液氮-80 ℃下速凍保存，在南京普東興生物科技有限公司提取總RNA，進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2 樣本表達(dá)譜測(cè)序及測(cè)序樣本信息注釋

以 TRIzol 法提取總RNA，采用Qubit 2.0熒光計(jì)進(jìn)行核酸精確定量，NanoDrop檢測(cè)其濃度，富集純化 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA，構(gòu)建測(cè)序文庫。使用Ion ProtonTM高通量測(cè)序儀測(cè)序，采用FastQC軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，過濾、去除低質(zhì)量堿基較多的reads和測(cè)序接頭[9]。過濾后的reads比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫，獲取測(cè)序信息。E-value值小于10～5為可信值，獲取reads信息，拼接獲得Unigenes及相對(duì)表達(dá)水平(RPKM)[10]，并對(duì)基因功能進(jìn)行注釋。

1.3 基因NR數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析及GO和KEEY分析

利用blast進(jìn)行NR數(shù)據(jù)庫物種分布比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)blast結(jié)果中每個(gè)能比對(duì)上的物種所對(duì)應(yīng)的基因數(shù)目。根據(jù)注釋信息，對(duì)基因進(jìn)行GO注釋，得到每個(gè)基因的GO注釋，包括細(xì)胞組成、分子功能及生物過程，探討真菌的基因功能特征。使用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)基因進(jìn)行KEGG注釋，了解基因在生物學(xué)上的代謝通路及功能。通過對(duì)基因功能進(jìn)行注釋分析，獲取感病過程中致病基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測(cè)序基本信息

RNA提取結(jié)果顯示，樣本濃度大于200ng/μl的最低要求；NanoDrop檢測(cè)OD260/280為2.084，RIN值為1.6，28S:18S值為8.1，所提取的樣本滿足建庫要求。經(jīng)測(cè)序獲得reads數(shù)3551251個(gè)，對(duì)reads進(jìn)行拼接獲得Unigene14446個(gè)，平均長度1093，RPKM值平均75，RPKM值小于5的Unigene數(shù)為11398個(gè)：RPKM值介于50～100基因數(shù)量為1556個(gè)，大于100基因數(shù)量為1491個(gè)，其中有167個(gè)Unigene的RPKM值超過1000。將測(cè)序結(jié)果與NR數(shù)據(jù)庫blast比對(duì)，能比對(duì)上的Unigene數(shù)量為14357個(gè)，按照物種統(tǒng)計(jì)，包含5種真菌，數(shù)目最多的是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，其次為富克葡萄孢盤菌(Botryotinia fuckeliana)。其中核盤菌和雪腐大粒菌核病(Sclerotinia borealis)為核盤菌科核盤菌屬真菌，富克葡萄孢盤菌為核盤菌科葡萄孢盤菌屬真菌，杯霉科盤二孢屬楊盤二孢菌(Marssonina brunnea)1個(gè)，一種產(chǎn)抗真菌生素相關(guān)絲狀真菌(Glarea lozoyensis)。核盤菌檢測(cè)到基因7292個(gè)，富克葡萄孢盤菌基因5271個(gè)，雪腐大粒菌核病基因738個(gè)，楊盤二孢菌基因266個(gè)。

表1 Unigene的NR數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析

2.2 Ungene GO分類

對(duì)Unigene進(jìn)行GO注釋，在細(xì)胞組成(cellular component)、基因分子功能(molecular function)、生物過程(Biological process)分別獲得8，4，19個(gè)注釋條目(class)。其中Unigene數(shù)量最多的是生物學(xué)過程，注釋到的Unigene數(shù)最少的是分子功能。生物學(xué)過程包括組織結(jié)構(gòu)形成(Anatomical structure formation)，生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)，發(fā)育進(jìn)程(Developmental process)，定殖(Establishment of localization)，色素淀積(pigmentation)等，分子功能主要包括結(jié)合(binding)，催化(catalytic)，分子結(jié)構(gòu)(structural molecule)和運(yùn)輸(transporter)。

2.3 Unigenes代謝通路分析

在生物體中，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于通路的分析，有助于進(jìn)一步的探索基因的生物學(xué)功能及基因調(diào)控機(jī)制的研究，KEGG數(shù)據(jù)庫以pathway為單位分析基因代謝通路及功能。通過KEGG注釋，共有1491個(gè)Unigenes被注釋，相關(guān)代謝通路有208個(gè)，Unigenes數(shù)較多的有代謝通路，次生代謝產(chǎn)物生物合成，微生物代謝和糖酵解等。

表2 KEGG注釋比例最多的前10個(gè)代謝通路

2.4 主要致病基因篩選

菌核病在侵染過程中分泌各種酶類及分泌草酸對(duì)植物細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行降解，包括纖維素，果膠，幾丁質(zhì)，淀粉，蛋白質(zhì)[11]。通過分析比對(duì)，篩選出小粒性菌核病菌絲侵染過程中致病相關(guān)基因，其中cAMP依賴性蛋白激酶(Camp-dependent protein kinase)類4個(gè)，多聚半乳糖醛酸酶(Ppolygalacturonase)類6個(gè)，幾丁質(zhì)酶(Chitinase)類6個(gè)，酸性蛋白(Acid protease)類3個(gè)：糖苷酶(Glucosidase)類8個(gè)，纖維二糖脫氫酶(Cellobiose dehydrogenase)類3個(gè)，膠質(zhì)酶(Cutinase)類4個(gè)，漆酶(Laccase)類1個(gè)，淀粉酶(Amylase)類4個(gè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)草酸生成關(guān)鍵基因草酰乙酸乙基水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase)表達(dá)。

圖2 核盤菌主要致病基因數(shù)量及占比

3 討 論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可對(duì)樣本進(jìn)行表達(dá)譜序列分析，高效的挖掘轉(zhuǎn)錄本有用信息。本研究通過對(duì)侵染期小粒性菌核病菌絲體總轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)注釋，探明該致病菌的主要致病基因及代謝途徑。發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染階段蛋白功能與結(jié)合、催化、分子結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸有關(guān)。富集到代謝通路208個(gè)，主要參與生化合成和次生產(chǎn)物代謝等生物學(xué)通路。為開展菌核病菌致病基因克隆，基因功能驗(yàn)證及生物防治提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

核盤菌侵染過程中表達(dá)產(chǎn)物多聚半乳糖酸酸酶(Polygalacturonase, PGs)[12]和草酸(Oxalic acid,OA)[13]在核盤菌科真菌的致病過程中起著關(guān)鍵作用。草酸能夠螯合鈣離子來降低果膠聚合物的穩(wěn)定性，從而增加病原菌產(chǎn)生的果膠酶進(jìn)入寄主的可能性以及寄主對(duì)果膠酶的敏感性，草酸還能夠抑制寄主植物的氧爆發(fā)和多酚氧化酶的活性。多聚半乳糖酸酸酶在核盤菌類病原真菌侵染過程中發(fā)揮著定植和致病因子的作用。此外草酸和多聚半乳糖醛酸酶存在著協(xié)同作用，核盤菌在侵染植物時(shí)產(chǎn)生的草酸能夠維持較低的pH環(huán)境，有利于包括聚半乳糖酸酸酶在內(nèi)的水解酶活性的發(fā)揮[14]。通過表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染過程中多聚半乳糖醛酸酶和生成草酸相關(guān)關(guān)鍵蛋白--草酰乙酸乙基水解酶都有表達(dá)，說明小粒性菌核病菌致病過程與其他核盤菌相似。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)漆酶、蛋白酶、果膠酶、糖苷酶、纖維素酶和淀粉酶等致病因子[15]。在這些酶作用下，可使桑椹子房內(nèi)果膠質(zhì)完全分解，降解細(xì)胞壁中的多聚糖結(jié)構(gòu)，迅速消解組織中膠層，引起細(xì)胞電解質(zhì)外滲、質(zhì)壁分離和軟腐。以上致病基因表達(dá)可使小粒性菌核病菌更容易侵染桑組織器官，導(dǎo)致桑椹腐敗，失去食用價(jià)值。

通過GO功能富集分析和代謝通路顯著性分析，發(fā)現(xiàn)小粒性菌核病菌在侵染初期次生代謝產(chǎn)物生物合成，氨基酸生物合成，糖酵解/糖異生途徑等顯著富集，并伴隨細(xì)胞定殖，色素沉積等生理過程，研究結(jié)果將為今后進(jìn)一步探索其侵染分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。