革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌所致膿毒癥大鼠心肌損傷后心肌酶變化的比較

陳雪陽，任 珊，許 航

膿毒癥是各種微生物及免疫原性物質(zhì)引起的機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，是外科大手術(shù)、嚴(yán)重創(chuàng)傷或燒傷等常見的并發(fā)癥。膿毒癥可累及多個(gè)器官，常伴有心血管系統(tǒng)的異常改變，包括膿毒癥心肌損傷[1-3]。目前膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有觀點(diǎn)認(rèn)為膿毒癥心肌損傷與信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥因子大量釋放、促炎/抗炎平衡失調(diào)，以及免疫系統(tǒng)紊亂均可能相關(guān)，并非單一致病機(jī)制[4,5]。革蘭氏陽性細(xì)菌（Gram-positive bacteria，G+）釋放的外毒素與革蘭氏陰性細(xì)菌（Gramnegative，G-）釋放的內(nèi)毒素所導(dǎo)致的膿毒癥心肌損傷的機(jī)制及嚴(yán)重程度不同，故本實(shí)驗(yàn)擬采取腹腔內(nèi)注射G+細(xì)菌（金黃色葡萄球菌）、G-細(xì)菌（大腸埃希菌）模擬不同細(xì)菌種類所致的膿毒癥，并腹腔注射等容積生理鹽水作為對(duì)照，分析G+和G-細(xì)菌所致膿毒癥大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心肌酶的表達(dá)變化，探討G+和G-細(xì)菌所致膿毒癥心肌損傷嚴(yán)重程度的差別。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD 大鼠45 只，體重250～350 g，7～9 周齡，購自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊疾控中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（新）2016—0004。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1～2 周，自由飲食。實(shí)驗(yàn)時(shí)將45 只大鼠稱重并分別編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3 組：革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組、革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組和生理鹽水組，每組各15 只大鼠。

1.1.2 試劑及儀器 模型制備所需金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌由新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾控中心惠贈(zèng)，cTnT、CK 和CK-MB 檢測(cè)試劑盒均購自寧波瑞源生物科技有限公司（批號(hào)：20140409）。7600-020 型全自動(dòng)生化分析儀購自日本HITACHI 公司。KDC-1044 低速離心機(jī)購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用腹腔內(nèi)注射細(xì)菌的方法制備大鼠膿毒癥模型。革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組：7.35×1012CFU/kg，3 ml；革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組：1.26×1012CFU/kg，3 ml；生理鹽水組：3 ml。大鼠腹腔注射選擇1 ml 注射器針頭連接5 ml 注射器針管，腹腔注射時(shí)右手持注射器，左手手指分別抓住老鼠尾部及背部皮膚，使大鼠頭部向下，防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。使注射器針孔向上，針尖以小于20 度的方向刺入皮下，貼腹壁向大鼠頭部方向稍推進(jìn)針頭，再以45 度方向刺入腹腔，進(jìn)針動(dòng)作輕柔；注射后大鼠放入籠內(nèi)，術(shù)后保持室溫在25℃，給予大鼠飼料和自來水，單籠飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本處理 革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組、革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組和生理鹽水組分別于造模成功后6、12 和24 h 經(jīng)尾靜脈采集靜脈血0.5 ml，分別采用試劑盒檢測(cè)血漿心肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTnT）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)整體分析采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)下各組比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠模型的建立 革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組大鼠于4 h 時(shí)開始出現(xiàn)豎毛、呼吸頻率加快，8 h 時(shí)出現(xiàn)腹瀉、大小便失禁和進(jìn)食水減少，14 h 時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呼吸急促和四肢肌張力降低，20 h 時(shí)出現(xiàn)嗜睡、皮溫低和眼球血性分泌物增加等癥狀；革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠于6 h 時(shí)開始出現(xiàn)呼吸頻率加快和活動(dòng)減少；9 h 時(shí)出現(xiàn)呼吸加快、進(jìn)食水減少和腹瀉，16 h 時(shí)出現(xiàn)呼吸急促、皮溫低和拒食；22 h 時(shí)出現(xiàn)四肢肌張力降低、眼球血性分泌物和嗜睡等癥狀；生理鹽水組大鼠均無上述癥狀。見表1。

2.2 血漿cTnT水平比較 革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿cTnT 濃度均顯著高于革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠和生理鹽水組大鼠（P＜0.05）；且隨著時(shí)間的延長，三組大鼠血漿cTnT 水平逐漸升高，均于24 h 達(dá)到峰值。革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿cTnT 濃度均顯著高于生理鹽水組（P＜0.05，表2）。

表1 革蘭氏陽性細(xì)菌對(duì)膿毒癥大鼠存活期生存率的影響

表2 各組大鼠血漿cTnT 變化（ng/ml，）

表2 各組大鼠血漿cTnT 變化（ng/ml，）

注：與生理鹽水組相比，①P＜0.05；與革蘭氏陽性細(xì)菌組相比，②P＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h生理鹽水組 6.23±0.47 6.24±0.49 6.25±0.63革蘭氏陽性細(xì)菌組 13.40±0.97① 16.94±0.83① 19.76±1.64①革蘭氏陰性細(xì)菌組 10.56±0.90①② 13.47±1.04①② 16.64±1.32①②

2.3 血漿CK水平比較 革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿CK 均顯著高于革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠及生理鹽水組大鼠（P＜0.05）；且隨著時(shí)間的延長，三組大鼠血漿CK 水平逐漸升高，均于24 h 達(dá)到峰值。革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿CK 濃度均顯著高于生理鹽水組大鼠（P＜0.05，表3）。

2.4 血漿CK-MB水平比較 革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿CK-MB 均顯著高于革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠及生理鹽水組大鼠（P＜0.05）；且隨著時(shí)間的延長，三組大鼠血漿CK-MB 水平逐漸升高，均于24 h 達(dá)到峰值（P＜0.05）。革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組大鼠6、12 和24 h 血漿CK-MB 濃度均顯著高于生理鹽水組大鼠（P＜0.05，表4）。

表3 各組大鼠血漿CK 變化（U/L，）

表3 各組大鼠血漿CK 變化（U/L，）

注：與生理鹽水組相比，①P＜0.05；與革蘭氏陽性細(xì)菌組相比，②P＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h生理鹽水組 403.23±64.23 409.64±53.29 411.07±57.24革蘭氏陽性細(xì)菌組 703.81±100.42① 901.70±90.62① 993.47±89.69①革蘭氏陰性細(xì)菌組 643.41±80.62①② 727.69±89.62①② 836.67±103.74①②

表4 各組大鼠CK-MB 變化（ IU/L，）

表4 各組大鼠CK-MB 變化（ IU/L，）

注：與生理鹽水組相比，①P＜0.05；與革蘭氏陽性細(xì)菌組相比，②P＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h生理鹽水組 7.64±1.08 7.96±0.97 8.03±1.14革蘭氏陽性細(xì)菌組 30.68±3.37① 49.67±3.49① 56.49±2.58①革蘭氏陰性細(xì)菌組 16.87±3.37①② 24.84±0.83①② 33.26±1.67①②

3 討 論

目前對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌導(dǎo)致膿毒癥的作用及病理生理機(jī)制已有較充分的認(rèn)識(shí)，但隨著革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥發(fā)生率的逐年升高，革蘭氏陽性細(xì)菌及其外毒素的作用亦逐漸引起重視。由于近年來多重耐藥菌的出現(xiàn)，膿毒癥的發(fā)病率持續(xù)升高，進(jìn)展迅速，嚴(yán)重程度也逐漸增加，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)展為感染性休克和引起多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[6,7]。膿毒癥仍是目前重癥患者死亡的主要原因。在膿毒癥導(dǎo)致的死亡患者中，超過50%的患者被證實(shí)有心肌損害和心肌功能障礙[8]。Martin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者均伴有心功能障礙，包括心臟收縮和（或）舒張功能障礙，尤其在嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克患者中。膿毒癥時(shí)交感神經(jīng)興奮性增加，引起促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。另外膿毒癥還可通過多種途徑激發(fā)全身細(xì)胞因子的釋放，炎性細(xì)胞因子的增加可直接損害心肌細(xì)胞[11]。

肌鈣蛋白（Tn）是肌肉收縮蛋白，位于收縮蛋白及細(xì)肌絲上，而心肌肌鈣蛋白僅存于心肌細(xì)胞中，cTnT 是其中一種亞單位組成的絡(luò)合物，cTnT 是心肌細(xì)胞特有的抗原在心肌細(xì)胞損傷時(shí)從心肌纖維上降解下來，cTnT 是心肌損傷的標(biāo)志物，對(duì)膿毒癥心肌損傷時(shí)的診斷有重要臨床意義；血清肌酸激酶（CK）廣泛存在于各組組織中，與三磷酸腺苷（ATP）的再生相關(guān)，在生理水平上維持細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度，其同工酶（CK-MB）主要存在于心肌細(xì)胞中，二者皆可反映心肌細(xì)胞損傷的程度。膿毒癥引起心肌損害時(shí)，促凋亡因子/抗凋亡因子比例失調(diào)，心肌細(xì)胞膜mPTP 孔道開放[12,13]，膜電位下降，線粒體崩解，ATP 生成障礙，從而亦使血清中肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-MB）升高，因此，血漿cTnT、CK 和CK-MB 是診斷心肌損傷的常用指標(biāo)，其上升幅度與心肌損害程度呈正比[14]，嚴(yán)重膿毒癥時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的毒素作用可致肌纖維的膜通透性異常或肌纖維損傷，大量心肌炎癥因子入血，血漿毒素水平上升[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇cTnT、CK、CK-MB 為膿毒癥后心肌損傷及其程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

革蘭氏陰性細(xì)菌主要通過釋放內(nèi)毒素引起組織器官損傷，內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱，是多種革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，由菌體裂解后釋放出的毒素，其化學(xué)成分是磷脂多糖-蛋白復(fù)合物，毒性成分主要是類脂類A[16]。革蘭氏陽性細(xì)菌的致病主要通過釋放外毒素，外毒素是病原菌生長繁殖過程中分泌到菌體外的一種代謝產(chǎn)物，是次級(jí)代謝產(chǎn)物，其主要成分為可溶性蛋白。革蘭氏陽性細(xì)菌釋放的外毒素可產(chǎn)生一種中毒性休克綜合毒素-1（超抗原）作用下，引起體內(nèi)炎癥因子的瀑布效應(yīng)[17]，使體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子，促炎/抗炎比例失調(diào)，從而攻擊心肌細(xì)胞，引起膿毒癥心肌損傷和心肌功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)研究表明分別采用腹腔內(nèi)注射金葡萄球菌和大腸埃希菌分別建造革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥和革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥模型，筆者發(fā)現(xiàn)隨著膿毒癥病情的發(fā)展，心肌損傷不斷加重，革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒癥組在各時(shí)間點(diǎn)的cTnT、CK 和CK-MB 濃度均顯著高于革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥組，表明外毒素作為免疫炎癥反應(yīng)中的“超抗原”，可引起炎癥因子產(chǎn)生級(jí)聯(lián)瀑布放大，攻擊心肌細(xì)胞致心肌細(xì)胞損傷，且造成的損傷要嚴(yán)重高于內(nèi)毒素引起的心肌損傷。

綜上，革蘭氏陽性細(xì)菌所致大鼠膿毒癥時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞損傷程度要顯著高于革蘭氏陰性細(xì)菌，因此在臨床上，革蘭氏陽性細(xì)菌所致膿毒癥心肌損傷應(yīng)引起足夠的重視。