基于ITS序列分析黑龍江東部地區(qū)市售黑木耳品種遺傳多樣性*

李睿瑞，荊瑞勇，楊 帆，郭嘉貴，李 磊，任墨涵，趙行健，王麗艷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑木耳（Auricularia auricula-judae） 是自然分布并廣泛栽培的食用菌之一[1]，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 層菌綱 （Hymenomycetes） 木耳目（Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳屬（Auricularia）[2]。我國黑木耳栽培歷史有1 000多年，經(jīng)長期的人工馴化，其遺傳背景非常復(fù)雜[3-4]。黑龍江東寧縣是我國最大的黑木耳批發(fā)集散地，收集與批發(fā)來自全國各地的黑木耳干品。在該地區(qū)調(diào)查不同黑木耳菌種，研究其遺傳背景，可避免盲目引種，或因菌種名稱混亂帶來的問題[5-6]，對本地引種篩選工作具有重要意義。

目前，黑木耳品種鑒定方法除傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)調(diào)查外，更準(zhǔn)確的是基于PCR的DNA指紋技術(shù)及酯酶同工酶法。路新彥等[7]研究發(fā)現(xiàn)酯酶同工酶、分子標(biāo)記法及拮抗試驗(yàn)法得到的結(jié)果一致，但酯酶同功酶方法穩(wěn)定性及可重復(fù)性不高，拮抗試驗(yàn)較直觀，但需要輔助或補(bǔ)充其他試驗(yàn)才能更確切，因此分子標(biāo)記的方法更加準(zhǔn)確。分子標(biāo)記方法有很多，包括PCR-RAPD （random amplified polymorphic DNA）[8-10]、ISSR （inter-simple sequence repeat）[11-13]及 ITS （internal transcribed spacer）[14-18]等，其中 ITS 方法應(yīng)用較多[14-18]。劉華晶等[15]利用ITS序列對大興安嶺地區(qū)野生黑木耳菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，野生菌株遺傳多樣性優(yōu)于栽培菌株。張丹等[16]對中國7個(gè)毛木耳菌株的ITS序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，供試6個(gè)菌株的ITS2區(qū)序列長度完全相同，整個(gè)ITS區(qū)共有11個(gè)變異位點(diǎn)，該分析結(jié)果支持傳統(tǒng)的依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行的木耳屬分類結(jié)果。張躍新等[14]對黑龍江地區(qū)8個(gè)野生黑木耳菌株和15個(gè)主栽黑木耳菌株的ITS序列進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)野生菌株間遺傳距離變化范圍大于栽培菌株。錢雪婷等[18]分析秦巴山區(qū)44個(gè)黑木耳菌株的ITS序列聚為5個(gè)分支，部分菌株間同源性較高，甚至可能為同一個(gè)種，只有菌株耳268與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究對東寧縣批發(fā)市場采集的11個(gè)黑木耳干品和牡丹江市售6個(gè)黑木耳試管斜面菌種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，通過對樣品ITS區(qū)間進(jìn)行測序和序列特征比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期為17種供試黑木耳的品種鑒定和遺傳背景分析提供理論依據(jù)，為東寧縣黑木耳種質(zhì)資源信息庫提供數(shù)據(jù)支撐，為當(dāng)?shù)睾谀径N篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試11份黑木耳干品收集于黑龍江省東寧縣黑木耳批發(fā)市場，形態(tài)特征見表1；供試6份試管菌種購于牡丹江，詳情見表1。

供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL；液體培養(yǎng)基：蔗糖 20 g、酵母粉 1 g、蛋白胨 1 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO41.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

表1 供試黑木耳干品與菌株Tab.1 Tested Auricularia auricula-judae dried samples and strains

1.2 黑木耳菌種的組織分離及純化培養(yǎng)

將供試黑木耳干品用無菌水泡發(fā)，用75%酒精沖洗表面，再用無菌水沖洗2次。切取0.5 cm見方的組織塊在無菌條件下接種于PDA培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d～7 d。待組織塊長出白色菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接至PDA斜面試管培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d～7 d后，同供試黑木耳試管菌種一起接種于液體培養(yǎng)基，于25℃、160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)7 d，獲得的菌絲球用無菌蒸餾水沖洗后，在無菌條件下取1 g于2 mL離心管中，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3 黑木耳菌種DNA的提取

采用改良CTAB法從菌絲體中提取DNA，具體操作如下：將2%的CTAB緩沖液700 μL和巰基乙醇7 μL加入2 mL離心管中混勻，置于65℃水浴鍋預(yù)熱備用。從超低溫冰箱中取出菌絲各1 g～2 g，迅速在液氨中充分研磨。研磨好的樣品裝入上述2 mL離心管中，混勻后放入65℃水浴鍋水浴40 min，每隔10 min顛倒混勻1次。取出離心管加入700 μL氯仿-異戊醇，混勻20 min，靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液至新的2 mL離心管。加入700 μL苯酚-氯仿-異戊醇，混勻20 min，靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液至新的2 mL離心管。加入異丙醇700 μL，顛倒混勻至白色絮狀沉淀出現(xiàn)，冰浴30 min，12 000 r·min-1離心10 min得到沉淀的DNA。棄上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，用無水乙醇清洗1次。風(fēng)干，加入50 μL的TE buffer溶解沉淀。

1.4 黑木耳ITS片段的PCR擴(kuò)增及克隆測序

使用真菌ITS通用引物[17]ITS 1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’） 和 ITS 4 （5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50.0 μL：Buffer 5.0 μL，dNTPs 5.0 μL，50.0 pmol·L-1的 ITS 引物各 0.5 μL，Taq 酶 1.0 μL，Template 1.0 μL，ddH2O 37.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min，16℃保存。取3 μL的PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒（Bio Gel Extraction Kit，BioFlux，北京） 回收目的片段。將獲得的DNA片段連接至pEASY T1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)PCR檢測陽性克隆，各選取3個(gè)陽性克隆送至測序公司進(jìn)行測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

測序獲得的ITS序列經(jīng) NCBI網(wǎng)站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上BLAST比對，與已發(fā)表的黑木耳ITS序列進(jìn)行同源性分析；將所有測序獲得的 ITS序列在日本 DNA數(shù)據(jù)庫 （DDBJ）（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）上Clustal W程序進(jìn)行序列間相似性比較；采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳菌株DNA提取、PCR擴(kuò)增及克隆

電泳檢測結(jié)果見圖1。

由圖1A可知，部分菌絲體DNA可獲得明顯的條帶。經(jīng)重復(fù)提取DNA，供試黑木耳干品均可獲得明顯的DNA條帶。由圖1B可知，以黑木耳DNA為模板、ITS 1/ITS 4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物均在600 bp左右。由圖1C可知，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆，以ITS 1/ITS 4為引物進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品的陽性克隆率均較高。

圖1 菌絲體DNA（A）、PCR片段（B）和陽性克?。–）檢測Fig.1 Detection of mycelium DNA(A),PCR fragments(B)and positive clones(C)

2.2 黑木耳菌種ITS序列比對

供試黑木耳ITS序列BLAST比對結(jié)果見表2。

由表2可知，供試黑木耳ITS序列經(jīng)測定，去除引物片段后發(fā)現(xiàn)，除8號菌株ITS序列長度為561 bp外，其他菌株ITS片段長度均為559 bp。BLAST比對結(jié)果顯示，供試17株黑木耳的ITS序列主要與Auricularia auricula-judaeE53 （KT964886）、Auricularia auricula-judaeHMSK （HQ388371） 和Auricularia auricula-judaeYAASM3687（KM884970） 序列同源性最高，均達(dá)到99%～100%。其中，Auricularia auricula-judaeE53菌株序列由錢雪婷等人提交，Auricularia auricula-judaeHMSK菌株序列由劉華晶等人提交，Auricularia auricula-judaeYAASM3687菌株序列由趙永昌提交，但針對該菌株的研究報(bào)道均未見發(fā)表。

供試黑木耳菌株ITS序列在核苷酸水平上相似性比較結(jié)果詳見表3。如表3所示，對供試黑木耳ITS序列進(jìn)行相似性比對發(fā)現(xiàn)，供試黑木耳菌株的ITS序列間相似性在98%～100%；其中8號、13號、15號、16號黑木耳菌株的ITS序列相似性達(dá)到100%，證明這四種黑木耳菌株為同一菌株，只是市售品種名稱不同。

2.3 黑木耳菌種的系統(tǒng)發(fā)育分析

供試17種黑木耳菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。

表2 供試黑木耳ITS序列BLAST比對結(jié)果Tab.2 BLAST results of tested Auricularia auricula-judae strains ITS sequences

表3 供試黑木耳菌株ITS序列在核苷酸水平上相似性比較結(jié)果Tab.3 Similarity comparison results of tested Auricularia auricula-judae strains ITS sequences at the nucleotide level

由圖2可知，供試17種黑木耳菌株聚為一支，可分為7個(gè)類型，其中1號、10號和14號菌株為Type I；2號菌株為Type II；8號、13號、15號、16號與Auricularia auricula-judaeE53菌株為Type III；6號和12號菌株為Type IV；17號菌株為Type V；3號、4號、7號和9號為Type VI；5號和11號與Auricularia auricula-judaeHMSK菌株為Type VII。

3 結(jié)論

ITS是真菌核糖體rDNA中18S、5.8S和28S間非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)，因其進(jìn)化速率快，長度適宜，被廣泛用于高等真菌種內(nèi)變異或?qū)賰?nèi)種間鑒定的分子標(biāo)記[14-17]。近年來基于ITS序列對黑木耳菌種的鑒定報(bào)道較多[15-16,18]。

圖2 基于ITS序列分析的供試黑木耳菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of tested Auricularia auricula-judae strains based on ITS sequences analysis.

黑木耳的子實(shí)體形態(tài)特征是鑒別黑木耳菌種較直觀的方法，但黑木耳栽培管理過程中有較多因素干擾黑木耳子實(shí)體的形成，如溫度[19]、濕度、光照等，為更準(zhǔn)確地了解黑木耳種質(zhì)資源，為當(dāng)?shù)匾雰?yōu)良黑木耳菌種資源，基于ITS序列分析技術(shù)結(jié)合子實(shí)體特征分析可高效地篩選獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黑木耳菌種。

本研究為調(diào)查黑龍江東部地區(qū)市售黑木耳種質(zhì)資源，收集了東寧縣黑木耳干品11種，結(jié)合牡丹江市售6種黑木耳試管菌種，通過組織分離、DNA提取、ITS序列擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)供試17種黑木耳可分為7種類型，表明東寧縣黑木耳批發(fā)市場黑木耳遺傳多樣性豐富。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分不同名品種的ITS序列進(jìn)化距離相同，說明市售黑木耳菌種存在商品名不同但實(shí)際為同一品種的情況，市場品種名稱較為混亂，這與王晗等[3]研究結(jié)果一致。劉華晶等[10]在研究黑木耳ITS序列時(shí)，測序得其長度在598 bp～784 bp，而本研究中供試黑木耳菌株的ITS序列在大部分為559 bp，可能因所采用的引物序列長度不同所致。以上結(jié)果為黑木耳種質(zhì)資源調(diào)查及當(dāng)?shù)睾谀径N提供理論指導(dǎo)。

由于東寧縣黑木耳批發(fā)市場黑木耳干品較多，本研究采集的樣品數(shù)量有限，在下一步研究中有必要擴(kuò)大采樣量，獲得更多的黑木耳菌種資源。