• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株高漆酶活性樹舌靈芝降解木質素條件的優(yōu)化*

    2019-10-21 06:49:12劉曉丹楊祥波
    中國食用菌 2019年9期
    關鍵詞:氮源靈芝木質素

    劉曉丹,王 霞,楊祥波,葉 飛

    (吉林農業(yè)科技學院生物工程學院,吉林 吉林 132101)

    農作物廢棄秸稈中含有大量難以被利用的木質素資源,同時木質素也是影響反芻動物瘤胃微生物消化的因素之一[1]。因此,如何提高微生物對木質素的降解效率成為近年來研究開發(fā)的熱點。據報道,木質素降解能力較強的微生物多為白腐真菌、軟腐真菌和褐腐真菌[2-4]。此類真菌通過合成漆酶(laccase,Lac)、錳過氧化酶 (manganese peroxidase,MnP) 和木質素過氧化物酶 (lignin peroxidase,LiP)[3,5]等一系列同功酶的方式發(fā)揮作用。

    靈芝不僅具有較高的藥理活性,還具有高效降解木質素的潛在特性[6]。目前國內外對靈芝屬的研究多集中在木質素降解酶系及單一酶發(fā)酵條件的分析方面,而關于木質素降解應用的研究相對較少。在前期分離到的1株樹舌靈芝(Ganoderma applanatum) 的基礎上,分析該菌株的降解酶系,進一步研究其對木質素的降解條件,為提高微生物對木質素的降解能力提供參考,同時對未來如何應用農作物廢棄物資源進行生物轉化或飼料加工等領域的研究具有重要意義。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    樹舌靈芝菌株由吉林農業(yè)科技學院生物工程學院微生物實驗室分離、鑒定并保存。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)基配方參考文獻[7]。

    愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基:含0.04%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基。

    產酶培養(yǎng)基[8]:小麥麩皮20.0 g·L-1、豆粕2.0 g·L-1、葡萄糖 20.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1。

    木質素降解培養(yǎng)基[3]:木質磺酸鈉2.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

    1.2 方法

    1.2.1 樹舌靈芝降解木質素的定性分析

    將活化后的樹舌靈芝菌株接種于愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng),12 h后觀察是否形成有色圈,測定菌落直徑d1及有色圈直徑d2,計算d1/d2的比值[9],初步分析樹舌靈芝降解木質素的特性。

    1.2.2 樹舌靈芝中木質素降解酶的動態(tài)分析

    將活化好的菌株,用打孔器取3塊直徑為5 mm的菌餅,接種至種子培養(yǎng)基中,28℃、120 r·min-1培養(yǎng)5 d后即為種子液,轉接至產酶培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。每隔2 d取5 mL發(fā)酵液,10 000 r·min-1離心8 min,取上清液測定酶活。

    木質素降解酶系的酶活測定:漆酶的活性測定采用ABTS法[10];錳過氧化物酶(MnP) 的活性測定參考Rogalski[11]的方法;木質素過氧化物酶(LiP)的活性測定采用藜蘆醇法[12]。

    1.2.3 木質素降解率的測定

    配制不同濃度梯度的木質磺酸鈉標準溶液,于280 nm波長下測定OD值,并繪制標準曲線[3]。木質磺酸鈉濃度與吸光值間的線性回歸方程為y=0.028 8x-0.028 3,相關系數R2=0.998 6。

    種子液按2%接種于降解培養(yǎng)基中,28℃、120 r·min-1培養(yǎng) 9 d。發(fā)酵液經 10 000 r·min-1離心 8 min,上清液經適當稀釋后,測定OD280值,計算木質磺酸鈉含量[13]。

    木質素降解率(P1,%)計算公式為:

    式中:P1表示木質素磺酸鈉降解率,C表示發(fā)酵后木質素磺酸鈉的含量。

    1.2.4 不同因素對樹舌靈芝降解木質素的影響

    將制備的種子液接種到降解培養(yǎng)基中,以木質素磺酸鈣為底物,發(fā)酵培養(yǎng)9 d后,測定木質素的降解率。以降解率為指標,分別考察降解培養(yǎng)基中不同氮源、氮源濃度、底物濃度、培養(yǎng)溫度及初始pH對樹舌靈芝降解木質素的影響。

    1.2.5 正交試驗優(yōu)化降解條件

    在單因素試驗結果的基礎上,進行 L9(34)正交試驗進一步優(yōu)化木質素降解條件。水平因素見表1。

    表1 正交試驗設計Tab.1 Design of orthogonal test

    1.2.6 驗證試驗

    按照正交試驗優(yōu)化的最適降解條件進行驗證,進行平行3次試驗,計算木質磺酸鈉的平均降解率。

    2 結果與分析

    2.1 產漆酶樹舌靈芝的定性分析

    樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析見圖1。

    圖1 樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析Fig.1 Colorimetric analysis of Ganoderma applanatum on plates supplemented with guaiacol

    樹舌靈芝菌餅接種于顯色培養(yǎng)基上,第2天即形成淡紅色有色圈,初步判斷該菌株可以產漆酶。第5天后菌落直徑達到最大,有色圈顏色明顯加深,呈棕紅色。進一步測定菌落直徑和有色圈直徑并計算d1/d2的比值,比值為 0.568~0.734,小于1.000時,初步判定該菌株可以選擇性降解木質素[14]。

    2.2 樹舌靈芝中木質素降解酶系的動態(tài)分析

    對木質素降解酶的測定結果如圖2所示。

    圖2 樹舌靈芝木質素降解酶系分析Fig.2 Ligninolytic enzymes analysis of Ganoderma applanatum

    由圖2可知,樹舌靈芝Lac酶活明顯高于LiP和MnP;發(fā)酵培養(yǎng)7 d時Lac酶活達到峰值,為735.2 U·L-1。其次是LiP,而MnP的活性相對較低。LiP和MnP酶活均在第5天檢測到峰值,分別為254.6 U·L-1和142.7 U·L-1。由此推斷樹舌靈芝木質素降解過程中漆酶可能發(fā)揮關鍵作用。

    2.3 不同因素對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    2.3.1 不同氮源對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    本研究分別選取無機氮源和有機氮源各3種,分析氮源對木質素降解率的影響。結果如圖3所示。

    圖3 氮源種類對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.3 Effect of nitrogen source species on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

    由圖3可知,以豆粕作為氮源時,木質素降解率達到32.22%,降解效果最好。后續(xù)試驗中選擇豆粕為主要氮源。

    2.3.2 不同氮源濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    適宜的氮源濃度有利于提高木質素降解率,對不同氮源濃度的試驗結果見圖4。

    圖4 氮源濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

    由圖4可知,氮源濃度為2.5 g·L-1時,木質素降解率最高。氮源濃度較高時,木質素降解率略低于氮源濃度較低時的降解率。

    2.3.3 不同底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    不同底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率影響的試驗結果見圖5。

    圖5 底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

    由圖5可知,當底物濃度為2 g·L-1時,降解效果最好,木質素降解率達到35.73%。當底物濃度大于5 g·L-1后,降解率迅速下降。分析原因可能是底物濃度升高后,隨著培養(yǎng)時間的延長,發(fā)酵液逐漸粘稠,會降低菌體對營養(yǎng)及氧氣的吸收[15],進一步抑制菌體分泌降解酶系,進而影響木質素的降解。

    2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    不同培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響試驗結果見圖6。

    圖6 培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.6 Effect of culture temperature on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

    由圖6可知,溫度一方面影響菌株的生長代謝,另一方面影響木質素降解速度。在30℃條件下,樹舌靈芝木質素降解率最高。溫度高于30℃時,木質素降解率顯著降低,與相對高溫下降解酶容易變性、失活有關。

    2.3.5 不同初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響

    不同初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響試驗結果見圖7。

    圖7 初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.7 Effect of initial pH on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

    由圖7可知,該菌株在pH 6.0~9.0之間,對木質素均有很好的降解效果。在pH為9.0時,木質素降解率仍能達到18.92%。pH過高或過低時,木質素降解率均明顯降低。

    2.4 樹舌靈芝木質素降解條件的優(yōu)化

    樹舌靈芝木質素降解條件的優(yōu)化的正交試驗結果見表2。

    表2 正交試驗結果Tab.2 Orthogonal test results

    由表2可知,樹舌靈芝降解木質素的最適發(fā)酵條件為氮源濃度2.5 g·L-1,底物濃度3.0 g·L-1,初始pH 6.0,發(fā)酵溫度28℃。極差分析結果表明,4個因素對木質素降解率的影響大小依次為氮源濃度>底物濃度>初始pH>培養(yǎng)溫度。各因素對試驗顯著性的影響如表3所示。

    由表3可知,氮源濃度對木質素降解率的影響顯著 (P<0.05)。

    表3 正交試驗顯著性分析結果Tab.3 Significance analysis results of orthogonal test

    2.5 驗證試驗

    根據正交試驗結果,選擇最優(yōu)降解條件,進行3次平行驗證試驗,得到優(yōu)化條件下樹舌靈芝木質素平均降解率,結果見表4。

    表4 驗證試驗結果Tab.4 Verification test results

    由表4可知,樹舌靈芝木質素降解率的平均值為44.72%,表明該發(fā)酵條件下木質素降解率較高,重復性好,符合最佳降解條件。

    3 討論

    靈芝屬菌類普遍具有高效降解木質纖維素的特性,在農作物秸稈的生物降解、造紙廢水的處理、飼料加工等領域具有廣闊的應用前景[6]。目前靈芝屬菌類的研究主要包括高產菌株的選育、產漆酶條件的優(yōu)化及酶生物學特性分析等基礎研究[16],應用研究中多集中在染料脫色方面,關于木質素降解的應用研究相對較少。

    真菌在不同生長階段分泌的木質素降解酶活性不同[17],有文獻報道[18]食用菌在菌絲體時期漆酶活性較高,因此本研究采用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌絲進行降解特性的分析。不同靈芝菌株的木質素降解酶活性差異很大,直接影響到木質素的降解率。本研究中對樹舌靈芝發(fā)酵培養(yǎng)分泌的木質素降解酶系分析表明,Lac酶活性明顯高于LiP和MnP;發(fā)酵培養(yǎng)7 d檢測到峰值,為735.2 U·L-1。劉禹等[19]分析了相同培養(yǎng)條件下,靈芝屬7個不同菌種漆酶活性間存在差異,其中有柄樹舌與信州靈芝的漆酶活性顯著高于其他菌種,有柄樹舌在第3天時即可檢測到高漆酶活性,信州靈芝在第6天達酶活峰值。王茂成等[20]對8種不同食用菌產酶情況進行分析,發(fā)現木耳和靈芝產酶活性最高,培養(yǎng)到第3天時,檢測到靈芝中Lac、LiP和MnP的酶活分別為508.6 U·L-1、112.3 U·L-1和 112.6 U·L-1。

    影響菌株合成和分泌木質素降解酶種類和活性的關鍵因素是培養(yǎng)體系中的碳源、氮源的種類、濃度[17]及培養(yǎng)條件。陶君等[21]研究發(fā)現,靈芝的最適產漆酶條件為麥芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃。潘志恒等[8]發(fā)現,樹舌靈芝發(fā)酵產漆酶最佳培養(yǎng)基為小麥麩皮20 g·L-1、豆粕2 g·L-1、硫酸銅 0.625 g·L-1、香蘭素 0.037 5 g·L-1。孫海鑫[22]研究發(fā)現,雜色云芝產漆酶培養(yǎng)基最優(yōu)組合為馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、麩皮 10 g·L-1、黃豆粉7 g·L-1。吳佳慧[23]研究表明,最適合靈芝K-17菌株產漆酶的營養(yǎng)成分為玉米粉、麩皮和花生殼。而Stajic等[24]研究表明,靈芝產LiP和MnP的最佳氮源是蛋白胨,Lac和MnP的最佳氮源NH4NO3。Batool等[25]對靈芝菌株IBL-05進行產酶條件的優(yōu)化時發(fā)現,選擇葡萄糖和尿素作為碳源、氮源,發(fā)酵培養(yǎng)6 d時,LiP酶活最高。王書超等[26]在對樹舌靈芝產漆酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化和分析其主要降解酶系的基礎上,在木質素降解特性試驗中選擇以豆粕2.0 g·L-1作為氮源,額外添加0.5 g·L-1葡萄糖補充碳源,以滿足菌絲體生長的需要。

    本研究中,在驗證樹舌靈芝能夠選擇性降解木質素的基礎上,采用液態(tài)發(fā)酵對樹舌靈芝的降解酶系進行分析,并通過正交試驗確定了液態(tài)發(fā)酵條件下樹舌靈芝降解木質素的最佳條件。目前課題組正在開展樹舌靈芝降解玉米和水稻秸稈的研究,以期為將來樹舌靈芝在農作物秸稈資源的生物轉化及飼料加工生產等方面的應用提供參考資料。

    猜你喜歡
    氮源靈芝木質素
    春天來了
    木質素增強生物塑料的研究進展
    上海包裝(2019年8期)2019-11-11 12:16:14
    一株“靈芝”——一位貧困婦女的脫貧自述
    當代陜西(2019年5期)2019-03-21 05:12:30
    菌草靈芝栽培技術
    現代園藝(2017年23期)2018-01-18 06:57:57
    一種改性木質素基分散劑及其制備工藝
    天津造紙(2016年1期)2017-01-15 14:03:29
    無機氮源對紅曲霉調控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    一種新型酚化木質素胺乳化劑的合成及其性能
    靈芝霜下秀
    中華手工(2014年11期)2014-12-03 02:31:53
    ABS/木質素復合材料動態(tài)流變行為的研究
    中國塑料(2014年4期)2014-10-17 03:00:45
    中藥渣生產蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    午夜视频精品福利| 国产av国产精品国产| 操出白浆在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久欧美国产精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 老司机在亚洲福利影院| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 免费少妇av软件| 妹子高潮喷水视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品一区在线观看国产| 99香蕉大伊视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久国产欧美日韩av| 99热全是精品| 99久久综合免费| 制服人妻中文乱码| 夫妻午夜视频| 欧美中文综合在线视频| 久久中文字幕一级| 丝瓜视频免费看黄片| 日日夜夜操网爽| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一区在线观看完整版| 十分钟在线观看高清视频www| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久中文看片网| 另类精品久久| 亚洲国产欧美网| 国产男人的电影天堂91| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久免费观看电影| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产野战对白在线观看| 9热在线视频观看99| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久视频综合| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲中文日韩欧美视频| 极品人妻少妇av视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩电影二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久99热这里只频精品6学生| 99久久国产精品久久久| 满18在线观看网站| 久久av网站| 999久久久国产精品视频| av电影中文网址| 777米奇影视久久| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久久av美女十八| 婷婷色av中文字幕| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧美色中文字幕在线| 午夜影院在线不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 一本久久精品| 色视频在线一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 精品久久蜜臀av无| 69av精品久久久久久 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产99久久九九免费精品| 久久这里只有精品19| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 波多野结衣一区麻豆| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产又爽黄色视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产一区二区三区av在线| 精品免费久久久久久久清纯 | 51午夜福利影视在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 18禁观看日本| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一级毛片电影观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产免费福利视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 丝瓜视频免费看黄片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产亚洲精品一区二区www | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲,欧美精品.| 久久毛片免费看一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 男女无遮挡免费网站观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精品第二区| 手机成人av网站| 美女国产高潮福利片在线看| 成年人午夜在线观看视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲欧美清纯卡通| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利影视在线免费观看| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲专区字幕在线| 亚洲欧美清纯卡通| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产真人三级小视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美另类一区| 正在播放国产对白刺激| 欧美精品av麻豆av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品第一国产精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产精品成人在线| 亚洲五月婷婷丁香| 香蕉国产在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 操出白浆在线播放| 一区二区av电影网| 午夜老司机福利片| 国产一区二区在线观看av| 久久这里只有精品19| 成人国产av品久久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 制服诱惑二区| bbb黄色大片| 亚洲av男天堂| 久久久久视频综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品一区在线观看国产| 91老司机精品| 黄色毛片三级朝国网站| 咕卡用的链子| 久久久久网色| 亚洲精品成人av观看孕妇| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久久久精品古装| 国产高清视频在线播放一区 | 欧美成狂野欧美在线观看| 99香蕉大伊视频| 免费不卡黄色视频| 人妻久久中文字幕网| 黑人猛操日本美女一级片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产成人精品久久二区二区免费| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲熟女毛片儿| 成年av动漫网址| 日本五十路高清| 在线观看一区二区三区激情| 一区福利在线观看| 午夜福利,免费看| 国产免费现黄频在线看| 国产亚洲精品久久久久5区| 电影成人av| tocl精华| bbb黄色大片| 少妇的丰满在线观看| 亚洲综合色网址| 国产高清国产精品国产三级| 窝窝影院91人妻| 国产在视频线精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 下体分泌物呈黄色| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲欧美色中文字幕在线| 另类亚洲欧美激情| 99国产精品免费福利视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 色老头精品视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产日韩欧美在线精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产三级黄色录像| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人影院久久av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 老司机福利观看| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美人与性动交α欧美软件| 麻豆乱淫一区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 成年动漫av网址| 一二三四社区在线视频社区8| 日本黄色日本黄色录像| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 老司机午夜福利在线观看视频 | tocl精华| 少妇的丰满在线观看| 两个人看的免费小视频| 丁香六月天网| 一区二区日韩欧美中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品亚洲av国产电影网| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美精品av麻豆av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲第一av免费看| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区三区综合在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产av国产精品国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 黄色 视频免费看| 日本欧美视频一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 午夜福利在线观看吧| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产成人啪精品午夜网站| 91精品国产国语对白视频| 国产精品1区2区在线观看. | 老司机影院毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 操美女的视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久精品区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本黄色日本黄色录像| 欧美精品一区二区大全| 免费观看a级毛片全部| 国产男女内射视频| 色播在线永久视频| 日韩一区二区三区影片| 成人国产一区最新在线观看| 在线永久观看黄色视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 丝袜人妻中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av不卡在线播放| 丝袜在线中文字幕| 两个人免费观看高清视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩大码丰满熟妇| 欧美黄色淫秽网站| 日日爽夜夜爽网站| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 午夜激情久久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久人人爽人人片av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| av有码第一页| 桃红色精品国产亚洲av| 人妻久久中文字幕网| 色播在线永久视频| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美黑人精品巨大| 丝袜美腿诱惑在线| 成年人黄色毛片网站| 国产精品 欧美亚洲| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久久国产电影| 精品乱码久久久久久99久播| 男女下面插进去视频免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 人人澡人人妻人| 一二三四在线观看免费中文在| av在线老鸭窝| 国产精品九九99| 国产色视频综合| 国产精品免费大片| 亚洲欧美清纯卡通| 嫩草影视91久久| www.999成人在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 秋霞在线观看毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精华国产精华精| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美在线黄色| 最近中文字幕2019免费版| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品一区二区免费欧美 | 欧美精品一区二区大全| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 18禁观看日本| 国产精品二区激情视频| 又大又爽又粗| www.熟女人妻精品国产| 9热在线视频观看99| 欧美在线黄色| 性色av乱码一区二区三区2| 两人在一起打扑克的视频| 99国产精品99久久久久| 久久久久久人人人人人| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产色视频综合| 两个人看的免费小视频| 国产日韩欧美视频二区| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产又爽黄色视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品国产国语对白av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 午夜免费鲁丝| 不卡一级毛片| www.999成人在线观看| 香蕉国产在线看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 丰满饥渴人妻一区二区三| 黄片小视频在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲国产精品一区三区| 国产日韩欧美视频二区| 久久av网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲熟女毛片儿| 午夜福利,免费看| 男人操女人黄网站| 亚洲色图综合在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 久久综合国产亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久九九热精品免费| 午夜免费鲁丝| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 黄色毛片三级朝国网站| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费在线观看影片大全网站| 一二三四社区在线视频社区8| 99香蕉大伊视频| 亚洲成人手机| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 1024香蕉在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 妹子高潮喷水视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99香蕉大伊视频| 国产片内射在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 色精品久久人妻99蜜桃| av天堂久久9| 老司机靠b影院| 久久精品人人爽人人爽视色| 操美女的视频在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女高潮到喷水免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | netflix在线观看网站| av在线老鸭窝| 性色av乱码一区二区三区2| √禁漫天堂资源中文www| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲精品不卡| 日本av免费视频播放| 亚洲国产欧美网| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲天堂av无毛| 水蜜桃什么品种好| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄片播放在线免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| tocl精华| 午夜激情av网站| 亚洲av电影在线进入| 久久午夜综合久久蜜桃| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩欧美免费精品| 精品久久久精品久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品欧美一区二区三区在线| 悠悠久久av| 日本av免费视频播放| 亚洲中文字幕日韩| 免费观看av网站的网址| 亚洲av片天天在线观看| 五月开心婷婷网| 日日爽夜夜爽网站| 久久亚洲国产成人精品v| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品九九99| 中文字幕av电影在线播放| 久久中文看片网| 成人国产av品久久久| 日本av手机在线免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产成人一精品久久久| 麻豆av在线久日| 狂野欧美激情性bbbbbb| 69av精品久久久久久 | 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美激情极品国产一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 搡老岳熟女国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 18禁观看日本| 美女主播在线视频| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲伊人色综图| 麻豆国产av国片精品| 9热在线视频观看99| 国产男女超爽视频在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产欧美日韩一区二区三 | av在线app专区| 最近最新免费中文字幕在线| 9191精品国产免费久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 波多野结衣av一区二区av| 黄片小视频在线播放| 男女国产视频网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| svipshipincom国产片| 高清视频免费观看一区二区| 9191精品国产免费久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲av男天堂| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲情色 制服丝袜| videosex国产| 欧美日韩av久久| 香蕉国产在线看| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级片'在线观看视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级黄色大片毛片| 国产国语露脸激情在线看| 天天影视国产精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩视频一区二区在线观看| 下体分泌物呈黄色| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 999久久久国产精品视频| 久久久久视频综合| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲国产欧美网| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产一区二区在线观看av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久免费观看电影| 亚洲专区中文字幕在线| 老司机福利观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 十八禁网站网址无遮挡| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品偷伦视频观看了| av线在线观看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99久久人妻综合| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品少妇内射三级| 电影成人av| 成人av一区二区三区在线看 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99久久99久久久精品蜜桃| 啪啪无遮挡十八禁网站| 悠悠久久av| 各种免费的搞黄视频| 宅男免费午夜| 亚洲av片天天在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9 | 婷婷色av中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲av成人一区二区三| 中国美女看黄片| 午夜视频精品福利| 久久久国产一区二区| 深夜精品福利| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品成人在线| 免费黄频网站在线观看国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99久久精品国产亚洲精品| 另类亚洲欧美激情| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 老熟女久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 黑人操中国人逼视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜精品国产一区二区电影| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| www.av在线官网国产| 色老头精品视频在线观看| 国产av又大| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲情色 制服丝袜| 性色av乱码一区二区三区2| 蜜桃国产av成人99| 亚洲avbb在线观看| 久久久国产精品麻豆| 少妇 在线观看| 极品人妻少妇av视频| 宅男免费午夜| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久久国产欧美日韩av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 老鸭窝网址在线观看| www.自偷自拍.com| 久久影院123| 一个人免费在线观看的高清视频 | 日本a在线网址| 国产一级毛片在线| www.精华液| 免费高清在线观看日韩| 久久久精品区二区三区| 亚洲综合色网址| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久国产精品影院| 成人国语在线视频| 在线天堂中文资源库| 手机成人av网站| 久久这里只有精品19| 久久中文看片网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲中文字幕日韩| 欧美一级毛片孕妇| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品国产三级国产专区5o| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| www.999成人在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 悠悠久久av| 国产精品 欧美亚洲| 99国产综合亚洲精品| 不卡一级毛片| 午夜久久久在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 老司机福利观看| 国产成人精品在线电影| 在线观看www视频免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精品国产区一区二| 午夜成年电影在线免费观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 热re99久久精品国产66热6| 国产男女内射视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲国产欧美日韩在线播放| www.熟女人妻精品国产| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 中文字幕高清在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 久久狼人影院| 91九色精品人成在线观看| 久久香蕉激情| 国产一卡二卡三卡精品|