樁蛋白基因克隆及其在肝癌細(xì)胞Hep G2中的作用

孫達(dá)權(quán)?石靜?石松?薛殿婷?徐瑩瑩

【摘要】目的 克隆樁蛋白基因（PXN）的蛋白編碼區(qū)并構(gòu)建PXN基因真核表達(dá)載體，建立PXN穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株，分析PXN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的作用。方法 Trizol法提取肝癌細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR法擴(kuò)增PXN基因蛋白編碼區(qū)并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEBFP-PXN。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep G2，G418篩選培養(yǎng)獲得樁蛋白高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株。實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析檢測細(xì)胞生長速率，細(xì)胞創(chuàng)傷-愈合實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移速率。蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 成功克隆PXN基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pEBFP-PXN。獲得樁蛋白高表達(dá)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株，胞內(nèi)顯示藍(lán)色熒光，蛋白免疫印跡法顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)株內(nèi)表達(dá)外源融合蛋白BFP-PXN。樁蛋白表達(dá)不影響Hep G2肝癌細(xì)胞的生長速率但可以抑制其細(xì)胞遷移，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)升高、間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin和Vimentin表達(dá)下降。結(jié)論 PXN基因不影響Hep G2肝癌細(xì)胞生長增殖速率但可以抑制其細(xì)胞遷移，這可能與其可以影響肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝癌細(xì)胞;樁蛋白基因;真核表達(dá);細(xì)胞遷移

樁蛋白基因（PXN）位于染色體12q24，有11個(gè)外顯子，可編碼559個(gè)氨基酸，其蛋白N端有5個(gè)亮氨酸-天冬氨酸酸性結(jié)合域（LD），可與黏著斑激酶（FAK）和紐蛋白結(jié)合，LD1到LD5結(jié)構(gòu)相似但功能各異;樁蛋白N端還有幾個(gè)脯氨酸富集SH3結(jié)合域;C端有4個(gè)串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域，每個(gè)LIM由2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)以疏水作用力結(jié)合，其中第3個(gè)LIM是樁蛋白與黏著斑蛋白重要結(jié)合區(qū)[1-2]。LIM不僅可以介導(dǎo)樁蛋白定位于黏著斑和細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白上，還與多種蛋白如微管蛋白、雄激素和糖皮質(zhì)激素的結(jié)合有關(guān)。樁蛋白上有許多酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如FAK/Src、ERK等信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，樁蛋白異常表達(dá)和異常磷酸化均與細(xì)胞生長、細(xì)胞黏附和遷移、形態(tài)轉(zhuǎn)變等密切相關(guān)[2]。本研究欲通過克隆PXN基因并使其在肝癌細(xì)胞Hep G2中高表達(dá)，分析其對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2生長和遷移的影響。

材料與方法

一、主要材料和試劑

Trizol 和lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司（美國），肝癌細(xì)胞株Hep G2購自中科院上海細(xì)胞庫，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司（美國），限制性核酸內(nèi)切酶、高保真反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司（中國大連），新生牛血清購自杭州四季青生物有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自北京天根生物有限公司，抗體購自北京博邁德生物有限公司，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析（RTCA）板購自艾森生物公司（美國），pEBFP-C1保存于本實(shí)驗(yàn)室。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%新生牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞。細(xì)胞長至80% ～ 90%用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

2. mRNA抽提及PCR反應(yīng)

將Hep G2鋪板于6 cm培養(yǎng)皿中，等細(xì)胞融合至80%時(shí)用PBS清洗3次，加入1 ml Trizol，充分吹打裂解細(xì)胞，移入1.5 ml離心管中，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫靜置10 min，4℃

12 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，取上清液移入新的1.5 ml離心管中，加入0.5 ml異丙醇，顛倒混勻后4℃ 7 500 轉(zhuǎn)/分離心10 min，棄去上清，加入1 ml預(yù)先配置好的75%的乙醇清洗，4℃ 7 500 轉(zhuǎn)/分離心10 min，棄去上清，室溫控干，加入RNase-free的雙蒸水100 μl，RNA完整性檢測并定量為1 μg/μl，

-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取4 μg總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按20 μl反應(yīng)體系在42℃逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，用PXN基因（NM_002859）引物（5-TGCTCGAGCCATGGACGACCTCGACGCCCTGCT-3，5-CAGAATTCCTAGCAGAAGAGCTTGAGGAAGCAG-3）擴(kuò)增獲得樁蛋白編碼區(qū)。

3. 真核表達(dá)載體構(gòu)建

用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ對(duì)PXN PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pEBFP-C1進(jìn)行雙酶切，電泳回收并純化后用T4 DNA ligase 4℃連接過夜，經(jīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選培養(yǎng)、單克隆挑取與擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提、Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA測序鑒定，獲得連接正確且未發(fā)生突變的重組質(zhì)粒pEBFP-PXN。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與藥物篩選

轉(zhuǎn)染前1 d將SMMC-7721細(xì)胞按50%量鋪于6孔板中，用lipofectamine 2000將無內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pEBFP-PXN穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染3 d后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，并用0.5%的胰酶消化后轉(zhuǎn)入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后加入600 μg/ml的G418進(jìn)行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后將G418濃度降低為維持濃度200 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞集落形成。熒光顯微鏡下挑取藍(lán)色熒光的細(xì)胞集落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

5. 蛋白免疫印跡法

取1.2×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解，蛋白定量后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，震蕩混勻后放入金屬浴中100℃煮沸5 min，瞬時(shí)離心后震蕩混勻，樣品進(jìn)行變性電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜和膜封閉后，加入一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗3次，加入二抗室溫孵育2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗3次，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯色反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞按最大數(shù)量接種于12孔板中，24 h后用10 μl槍頭按使用力度相同和劃線粗細(xì)相同的原則對(duì)細(xì)胞以“|”方式進(jìn)行劃痕，磷酸鹽緩沖液洗去懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，并在0、24、48、72 h拍照記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7. RTCA

細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取一部分細(xì)胞稀釋至1×104/ml，充分混勻后取200 μl細(xì)胞懸液加入到RTCA儀配套的細(xì)胞培養(yǎng)板中，按程序設(shè)置實(shí)驗(yàn)名稱、細(xì)胞類型、初始數(shù)量、掃描方式和頻率，啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)程序直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、重組真核表達(dá)載體pEBFP-PXN構(gòu)建成功

以Hep G2細(xì)胞mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，經(jīng)PCR反應(yīng)獲得PXN基因蛋白編碼區(qū)，經(jīng)Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ雙酶切后插入真核表達(dá)載體pEBFP-C1中，構(gòu)建PXN基因真核表達(dá)載體pEBFP-PXN（圖1A）。對(duì)pEBFP-PXN用Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ雙酶切進(jìn)行鑒定（圖1B），并對(duì)其進(jìn)行DNA正反測序，結(jié)果證明PXN基因無點(diǎn)突變，正是所需重組質(zhì)粒。

二、建立PXN基因高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

去內(nèi)毒素的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEBFP-PXN用脂質(zhì)體法穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep G2，并用G418藥物篩選殺死未轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞形成單克隆集落時(shí)，在熒光顯微鏡下挑取細(xì)胞集落并擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察（圖2）。蛋白免疫印跡法檢測分析發(fā)現(xiàn)，單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞內(nèi)外源融合蛋白BFP-PXN高表達(dá)（圖3A）。

三、PXN基因抑制肝癌細(xì)胞遷移并影響EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)

為研究PXN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的作用，首先利用RTCA法對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株的生長增殖速率進(jìn)行測定，如圖4所示，與對(duì)照細(xì)胞相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株的生長增殖速率無顯著變化（72 h：t = 0.438，P = 0.684），證明PXN基因基本不影響Hep G2肝癌細(xì)胞的生長增殖速率。然后，利用細(xì)胞劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)外源蛋白BFP-PXN的穩(wěn)轉(zhuǎn)株的細(xì)胞遷移能力降低（24 h：t = 5.177，P = 0.007;48 h：t = 8.307，P = 0.001;72 h：t = 5.498，P = 0.005），證明樁蛋白高表達(dá)可以抑制Hep G2肝癌細(xì)胞的遷移能力（圖5）。同時(shí)，蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)，指示細(xì)胞間質(zhì)化的標(biāo)志蛋白N-Cadherin（t = 4.374，P = 0.049）和Vimentin（t = 10.672，P = 0.009）表達(dá)降低，而指示細(xì)胞上皮化的標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)升高（t = -10.223，P = 0.009）（圖3B）。

討論

樁蛋白是一種具有多結(jié)構(gòu)域和多功能的黏著斑手腳架蛋白，可通過募集多種結(jié)構(gòu)蛋白和信號(hào)分子參與細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。樁蛋白上有多個(gè)酪氨酸和絲氨酸殘基參與磷酸化，與蛋白定位和生物學(xué)功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)整合素結(jié)合到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）上可以促進(jìn)樁蛋白的磷酸化水平，從而募集胞內(nèi)多種蛋白包括FAK和Src結(jié)合到樁蛋白的N端，結(jié)合的FAK可磷酸化樁蛋白的Tyr31和Tyr118，Src可磷酸化Tyr88和Tyr118，使磷酸化的樁蛋白與下游靶蛋白p130cas作用，介導(dǎo)由ERK從胞外傳導(dǎo)來的信號(hào)，最終影響細(xì)胞的黏附和遷移[3-4]。

在腫瘤細(xì)胞中，雖然樁蛋白磷酸化水平與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，但樁蛋白表達(dá)量與癌細(xì)胞的關(guān)系較為復(fù)雜[5-8]。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，樁蛋白表達(dá)上調(diào)與腫瘤病理分級(jí)高、淋巴管侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并認(rèn)為這可能與樁蛋白調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果與趙珊珊等在卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果極為類似[10]。另外，Shekhar等[11]也發(fā)現(xiàn)在口腔癌中，樁蛋白表達(dá)量與腫瘤發(fā)展和進(jìn)程呈正相關(guān)。同樣的，Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中，樁蛋白表達(dá)顯著高于正常組織和良性前列腺增生組織，并與前列腺癌更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、耐化療藥物和術(shù)后浸潤相關(guān)。但是，在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，Sobkowicz等[13]發(fā)現(xiàn)用小干擾RNA（siRNA）敲低細(xì)胞內(nèi)源性樁蛋白后，前列腺癌細(xì)胞的生長速度和轉(zhuǎn)移侵襲能力未發(fā)生明顯變化;在前列腺癌細(xì)胞LNCap中，siRNA敲低細(xì)胞內(nèi)源性樁蛋白后，前列腺癌細(xì)胞的生長增殖速度和轉(zhuǎn)移浸潤能力增強(qiáng)，但其黏附能力并未發(fā)生顯著變化。在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，敲低內(nèi)源性樁蛋白不影響細(xì)胞的增殖能力，但可以增強(qiáng)黏附力和降低細(xì)胞浸潤能力[12]。綜上所述，樁蛋白表達(dá)高低與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移侵襲之間關(guān)系較為復(fù)雜，它在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有不同的作用和功能，因此，要全面了解樁蛋白在腫瘤中的作用就需要在不同的腫瘤中用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

原發(fā)性肝癌是一種轉(zhuǎn)移可能性大的惡性腫瘤，為正確認(rèn)識(shí)樁蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先克隆了PXN基因蛋白編碼區(qū)，并構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pEBFP-PXN及其穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆肝癌細(xì)胞株[14]。蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)外源PXN融合蛋白的肝癌細(xì)胞，其細(xì)胞增殖速率未發(fā)生顯著改變，但細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制;同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)上皮化標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)顯著升高，間質(zhì)化標(biāo)志蛋白N-Cadherin和Vimentin表達(dá)降低，這些結(jié)果說明樁蛋白高表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞Hep G2的遷移能力，可以作為臨床肝癌診斷和治療的潛在靶標(biāo)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] López-Colomé AM， Lee-Rivera I， Benavides-Hidalgo R， López E. Paxillin： a crossroad in pathological cell migration. J Hematol Oncol， 2017， 10（1）：50.

[2] Yang WJ， Zhong J， Yu JG， Zhao F， Xiang Y. The structure and functions of paxillin and its roles in neovascularization. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2017， 21（8）：1768-1773.

[3] Deakin NO， Turner CE. Paxillin comes of age. J Cell Sci， 2008，121（Pt 15）：2435-2444.

[4] Zaidel-Bar R， Milo R， Kam Z， Geiger B. A paxillin tyrosine phosphorylation switch regulates the assembly and form of cell-matrix adhesions. J Cell Sci，2007， 120（Pt 1）：137-148.

[5] Mantonakis E， Giaginis C， Pikoulis E， Felekouras E， Patsouris E， Liakakos T， Papalampros E， Theocharis S. FAK， Src and p-Paxillin expression is decreased in liver metastasis of colorectal carcinoma patients. J BUON， 2017， 22（5）：1097-1106.

[6] Zhang D， Wu H， Zhang X， Ding X， Huang M， Geng M， Li H， Xie Z. Phosphoglycerate mutase 1 predicts the poor prognosis of oral squamous cell carcinoma and is associated with cell migration. J Cancer， 2017， 8（11）：1943-1951.

[7] Mekhdjian AH， Kai F， Rubashkin MG， Prahl LS， Przybyla LM， McGregor AL， Bell ES， Barnes JM， DuFort CC， Ou G， Chang AC， Cassereau L， Tan SJ， Pickup MW， Lakins JN2， Ye X， Davidson MW， Lammerding J， Odde DJ， Dunn AR， Weaver VM. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Mol Biol Cell， 2017， 28（11）：1467-1488.

[8] Cui S， Wang J， Wu Q， Qian J， Yang C， Bo P. Genistein inhibits the growth and regulates the migration and invasion abilities of melanoma cells via the FAK/paxillin and MAPK pathways. Oncotarget， 2017， 8（13）：21674-21691.

[9] Liu Q， Wang J， Tang M， Chen L， Qi X， Li J， Yu J， Qiu H， Wang Y. The overexpression of PXN promotes tumor progression and leads to radioresistance in cervical cancer. Future Oncol， 2018， 14（3）：241-253.

[10] 趙姍姍，李夢熊，徐娟，沈慧敏. 卵巢腫瘤中樁蛋白 paxillin 的表達(dá)及其臨床意義. 新醫(yī)學(xué)， 2014，45（11）： 714-717.

[11] Shekhar S， Angadi PV. Evaluation of paxillin expression in patients with oral squamous cell carcinoma： an immunohi-stochemical study. J Oral Maxillofac Pathol， 2017， 21（2）：318-319.

[12] Zheng QS， Chen SH， Wu YP， Chen HJ， Chen H， Wei Y， Li XD， Huang JB， Xue XY， Xu N. Increased Paxillin expression in prostate cancer is associated with advanced pathological features， lymph node metastases and biochemical recurrence. J Cancer， 2018， 9（6）：959-967.

[13] Sobkowicz AD， Sanders AJ， Mason MD， Jiang WG. Potential imp-lication of paxillin in cancer establishment within the bone environment. Anticancer Res， 2017， 37（8）：4255-4268.

[14] 周鵬志，譚慧珍，黃越前，彭文明. 原發(fā)性肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床分析——附57例報(bào)告. 新醫(yī)學(xué)，2009，40（5）： 298-300.

（收稿日期：2019-05-12）

（本文編輯：楊江瑜）