細(xì)胞外囊泡的分離及鑒定方法

邊素艷?劉宏斌

【摘要】細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱。根據(jù)EV的生成方式、大小或功能不同，可以分為外泌體、微囊泡和凋亡小體等不同亞群。EV的體積小、密度低、分離難度大，而且不同的分離方法得到的EV理化性質(zhì)不同。目前對(duì)EV的認(rèn)識(shí)尚不充分，鑒定方法也缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，是制約EV研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化的最主要因素。該文就EV的分類、產(chǎn)生機(jī)制、特征以及EV的分離和鑒定方法進(jìn)行綜述，為EV的研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞外囊泡;外泌體;微囊泡;分離;鑒定

細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱，囊泡的直徑從數(shù)十納米至數(shù)微米。幾乎所有活細(xì)胞均可釋放EV，它們存在于各種生物流體中，如血液、唾液、尿液以及細(xì)胞外環(huán)境等。

越來越多的證據(jù)表明，EV中包含母細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)（如CD9、CD63、CD81、MHC-I等）、脂類、核苷酸[包括DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、環(huán)狀RNA（cirRNA）及其他非編碼RNA]和糖等多種生物活性物質(zhì)，通過靶細(xì)胞內(nèi)化、受體-配體間相互作用或脂質(zhì)膜融合等方式，廣泛參與細(xì)胞之間的信息傳遞，對(duì)維持各種生理過程至關(guān)重要，如免疫監(jiān)視、凝血、干細(xì)胞維護(hù)、組織修復(fù)等。此外，有研究發(fā)現(xiàn)EV還參與傳染病和炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種病理過程，可用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)等，同時(shí)由于它們具有遞送生物活性物質(zhì)的功能，可開發(fā)成為新的藥物載體。這些EV的存在為多方位、多角度揭示疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了豐富的生物學(xué)信息，有望成為生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用開發(fā)的技術(shù)平臺(tái)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來源的EV具有與MSC相似的生物學(xué)效應(yīng)，如減少細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、抑制纖維化、提高組織修復(fù)潛力等，而且易提取、改造，與干細(xì)胞移植相比致瘤風(fēng)險(xiǎn)低，在損傷修復(fù)的生物學(xué)治療中具有廣闊應(yīng)用前景[2]。

鑒于EV具有重要生物學(xué)功能、廣闊的研究和應(yīng)用前景，近年來對(duì)EV的研究呈指數(shù)性增長，作為一個(gè)新興領(lǐng)域受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。然而，由于EV的體積非常小，對(duì)其分離、觀察和鑒定具有一定的挑戰(zhàn)性，尋找高效的EV分離和鑒定方法是研究的前提。本文就上述問題進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，為EV的研究提供一定的參考。

一、EV的分類、產(chǎn)生機(jī)制及特征

根據(jù)EV的生成方式、大小或功能不同，可以分為起源于內(nèi)吞途徑的外泌體、質(zhì)膜釋放的微囊泡和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的凋亡小體3種亞群[1]。

3種EV亞群的產(chǎn)生機(jī)制不同。外泌體起源于細(xì)胞的內(nèi)涵體系統(tǒng)[2]。首先細(xì)胞膜內(nèi)陷形成初級(jí)內(nèi)涵體，內(nèi)涵體膜再次內(nèi)陷形成多個(gè)腔內(nèi)小泡，此時(shí)包含多個(gè)腔內(nèi)小泡的內(nèi)涵體即次級(jí)內(nèi)涵體也叫做多囊泡體。多囊泡體是真核細(xì)胞重要的蛋白運(yùn)輸與分揀中心，當(dāng)多囊泡體與胞膜融合后，其內(nèi)的管腔狀囊泡凹陷，以內(nèi)出芽方式形成直徑為30 ～ 120 nm顆粒狀小囊泡，并釋放入細(xì)胞外環(huán)境，即外泌體。微囊泡是細(xì)胞質(zhì)膜直接以“出苞”的方式向細(xì)胞外突出形成的大囊泡，直徑為100 ～ 1000 nm。凋亡細(xì)胞的胞膜內(nèi)陷，分割包裹核碎裂形成的染色質(zhì)塊（核碎片）和胞質(zhì)，然后通過出苞或起泡等方式，從細(xì)胞脫落形成一些大小不等的囊泡，即凋亡小體。此外，凋亡細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器和胞質(zhì)成分被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹形成自噬體，與凋亡細(xì)胞膜融合后，排出體外也可形成凋亡小體，直徑800 ～ 5000 nm。這3種EV亞群的特征見表1。本文中EV主要指外泌體和微囊泡。

EV的組成成分并非隨機(jī)的，研究表明，細(xì)胞在不同的狀態(tài)分泌的EV內(nèi)含物不同，每一個(gè)EV都會(huì)攜帶特定的分子信息，包裝的獨(dú)特分子構(gòu)成決定了要傳遞給受體細(xì)胞的細(xì)胞外信號(hào)的類型，而且由一個(gè)復(fù)雜的分選系統(tǒng)來決定那些分子能夠進(jìn)入細(xì)胞外囊泡[3]。4種不同的機(jī)制可用于描述這種“貨物”裝載方式：轉(zhuǎn)運(yùn)需要的內(nèi)涵體分選復(fù)合物（ESCRT）機(jī)器及相關(guān)蛋白質(zhì)、大量脂質(zhì)、高階聚化反應(yīng)、通過神經(jīng)酰胺分離成微區(qū)。

二、分離方法

EV的體積小、密度低，分離難度大，而且不同的分離方法得到的EV理化性質(zhì)不同，這導(dǎo)致了EV研究存在大量不可控性和難重復(fù)性，是制約EV研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化的最主要因素[4]。利用EV的物理和生物化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多分離技術(shù)，如超速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法、基于微流控的分離技術(shù)等[5]。但是，在所有已知的方法中，還沒有同時(shí)滿足快速、簡便、高效及提取的EV形態(tài)、純度、產(chǎn)量和生物活性均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的方法。目前商品化的沉淀試劑盒提取外泌體速度快，產(chǎn)量高，但是價(jià)格較為昂貴，試劑殘留較多，有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)后續(xù)的功能試驗(yàn)影響較大。只有將現(xiàn)有的提取方法進(jìn)行整合，才能有效降低樣本中的雜質(zhì)[4]。目前普遍應(yīng)用的提取外泌體的方法主要是針對(duì)外泌體內(nèi)生物活性物質(zhì)的研究，一旦將其應(yīng)用于臨床治療，尋找有效提高外泌體純度和產(chǎn)量的方法亟待解決。圖1、表2匯總了目前常用分離方法的工作原理和優(yōu)缺點(diǎn)。

除了上述方法外，還有一些學(xué)者嘗試用離子體共振生物傳感器、納米脂質(zhì)探針系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、基于膽固醇含量的熱輔助聲流體分離囊泡的技術(shù)、旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)、免疫修飾的超順磁性納米顆粒等技術(shù)，為快速、高效和高純度的EV分離和洗脫提供新的途徑，進(jìn)而有益于外泌體的應(yīng)用[6]。

EV的穩(wěn)定性較好，易于保存。常用的保存方法是將其重懸于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中，凍存在-80℃的條件下，可保存1年，且不改變其形態(tài)和生物學(xué)特性。-20℃條件凍存可穩(wěn)定保存6個(gè)月[7]。最新研究表明，低pH的酸性環(huán)境有利于EV的穩(wěn)定保存，并且能夠提高EV的產(chǎn)量[8]。

三、鑒定方法

目前對(duì)EV（主要是外泌體）的鑒定方法包括形態(tài)學(xué)、粒子大小、表面標(biāo)志物等方面，分述如下：

1.基于抗體的鑒定方法

鑒于EV是在細(xì)胞膜通路中產(chǎn)生的，因此與此通路相關(guān)的抗體靶向標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行鑒定。其中包括四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63和CD81）、AIP1/Alix、TSG101和CD326/EPCAM[9]。蛋白鑒定的方法可使用蛋白免疫印跡法。這一方法可與以下所述的一些技術(shù)結(jié)合使用，以確定EV的種群。

2. 透射電鏡

透射電鏡可用于觀察EV的表面特征。將純化的EV置于懸浮液中，放在顯微鏡樣品格上，用醋酸鈾和纖維素進(jìn)行陰性染色后，透射電鏡可清晰地顯示EV的形態(tài)。鏡下觀察，EV呈現(xiàn)雙層膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)，常被描述為“杯子形狀”，然而這也可能是處理樣品時(shí)因烘干造成的假象。因此，這一方法不應(yīng)作為EV的一個(gè)明確特征，也不能用于EV來源的鑒定。

在電鏡檢查準(zhǔn)備中，相較單一的陰性染色，還可對(duì)上述抗原進(jìn)行單一或雙重染色，然后使用具有抗體特異性的不同大小的金納米粒子（例如一個(gè)抗體6 nm，另一種10 nm）來進(jìn)行二次染色。在電子顯微圖像中，這些納米粒子可以清楚地區(qū)分不同大小的EV[10]。此外，還可用標(biāo)準(zhǔn)的組織電子顯微技術(shù)進(jìn)行鑒定，通過抗體和組織切片的結(jié)合，得到更準(zhǔn)確的EV存在的評(píng)估方法[11]。

3. 根據(jù)粒子大小的鑒定方法

根據(jù)粒子大小對(duì)EV進(jìn)行鑒定最常用方法之一是NanoSight納米粒子跟蹤分析技術(shù)（NTA）。這一技術(shù)是在光學(xué)顯微鏡上安裝了高清攝像機(jī)，利用光散射和布朗運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，通過斯托克斯-愛因斯坦方程（納米顆粒在其懸濁液中單位時(shí)間內(nèi)的移動(dòng)速度與其本身的粒度、溶液的粘度和溫度存在數(shù)量上的關(guān)系），對(duì)50 ～ 1000 nm直徑范圍內(nèi)特定的外泌體和微囊泡進(jìn)行逐個(gè)直接成像和觀察，得到與之相關(guān)的高分辨率的粒度分布數(shù)據(jù)和濃度信息，可用于外泌體的半定量檢測(cè)。與透射電鏡不同，不需要干燥、固定以及冷凍等檢測(cè)前處理，NTA可實(shí)現(xiàn)原位、更接近其原始狀態(tài)下測(cè)試，對(duì)EV顆?？商峁┙Y(jié)構(gòu)與功能上的保護(hù)，保證了測(cè)量數(shù)據(jù)的真實(shí)性和有效性。

替代NTA的還有動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）[12]。這兩種技術(shù)都是基于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)原理。然而，DLS是通過測(cè)量樣本的激光散射來計(jì)算粒子的速度，而不是測(cè)量粒子在給定時(shí)間的運(yùn)動(dòng)距離。另外，IZON qNano能根據(jù)可調(diào)諧電阻脈沖傳感技術(shù)測(cè)量粒子的大小和濃度[13]。

上述方法需要的樣本量非常小，而且具有可靠、半定量、快速和易用等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是，這些方法不能確定EV的來源，而且可能包括膜和其他細(xì)胞的碎片，或脂蛋白復(fù)合物。因此，這些技術(shù)應(yīng)與其他更多的“定性”技術(shù)相結(jié)合，特別是電鏡，來對(duì)EV進(jìn)行鑒定。

4. 流式細(xì)胞儀

EV由于顆粒太小，低于常規(guī)流式細(xì)胞儀分析的閾值，因此不能準(zhǔn)確區(qū)分粒子與噪聲。外泌體熒光標(biāo)記后可以被流式細(xì)胞儀識(shí)別，但由于“蜂擁效應(yīng)”儀器本身無法準(zhǔn)確地將粒子與噪音分開，故而粒子的多少不能被量化[14]。替代的方法是使用乳膠微球直接或以EV特異性抗體間接來綁定EV，這種抗體結(jié)合的乳膠微球可自行制作或商業(yè)化購買。然后，被綁定的EV還可以用其他熒光結(jié)合的特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記。由于不清楚每個(gè)乳膠微球上綁定了多少粒子，因此粒子的數(shù)量仍不能直接獲得，但這種方法用于分析EV的表面抗原[15]。

5. 熒光和共聚焦顯微技術(shù)

EV可以用親脂性膜結(jié)合染料（如PKH67、DiD等）進(jìn)行標(biāo)記，也可利用其表面的巰基對(duì)EV進(jìn)行標(biāo)記[16-18]。此技術(shù)不能真正對(duì)每個(gè)EV進(jìn)行可視化，但可用于標(biāo)記的EV能否被細(xì)胞攝取的研究。

6. 其他方法

其他檢測(cè)單個(gè)EV的方法有原子力顯微鏡、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、拉曼光譜分析、微核核磁共振、小角度X射線散射、反常SAXS和電阻脈沖傳感等[19]。

上述鑒定方法可結(jié)合使用，根據(jù)國際EV協(xié)會(huì)于2014年發(fā)表的一個(gè)指導(dǎo)手冊(cè)，建議鑒定外泌體首先需要通過蛋白免疫印跡法來鑒定EV的標(biāo)志蛋白是否存在于樣品中，然后通過電子顯微鏡來觀察樣品中EV的形態(tài)特征，通過NTA等手段來分析樣品中EV的群體特征（粒子濃度、直徑分布等）。其他方法可根據(jù)研究需要決定是否應(yīng)用。

綜上所述，EV作為廣泛存在的、參與細(xì)胞間信息傳遞的生物活性物質(zhì)，在生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。作為近年來研究的新興領(lǐng)域，EV的分類、產(chǎn)生機(jī)制、特征也逐漸被認(rèn)識(shí)，然而，由于EV體積小、密度低，其分離、鑒定難度大，是制約研究和轉(zhuǎn)化的重要因素。結(jié)合不同機(jī)理的分離和鑒定方法，以及開發(fā)更為高效、便捷的技術(shù)，是解決EV研究的重要途徑。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Raposo G， Stoorvogel W. Extracellular vesicles： exosomes， microvesicles， and friends. J Cell Biol，2013，200（4）：373-383.

[2] Huang L， Ma W， Ma Y， Feng D， Chen H， Cai B. Exosomes in mesenchymal stem cells， a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases？ Int J Biol Sci，2015，11（2）：238-245.

[3] Kim HS， Choi DY， Yun SJ， Choi SM， Kang JW， Jung JW， Hwang D， Kim KP， Kim DW. Proteomic analysis of microve-sicles derived from human mesenchymal stem cells. J Proteome Res，2012，11（2）：839-849.

[4] Paolini L， Zendrini A， Di Noto G， Busatto S， Lottini E， Radeg-hieri A， Dossi A， Caneschi A， Ricotta D， Bergese P. Residual matrix from different separation techniques impacts exosome biological activity. Sci Rep，2016，6：23550.

[5] Coumans FAW， Brisson AR， Buzas EI， Dignat-George F， Drees EEE， El-Andaloussi S， Emanueli C， Gasecka A， He-ndrix A， Hill AF， Lacroix R， Lee Y， van Leeuwen TG， Mackman N， M?ger I， Nolan JP， van der Pol E， Pegtel DM， Sahoo S， Siljander PRM， Sturk G， de Wever O， Nieuwland R. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res，2017，120（10）：1632-1648.

[6] Cai S， Luo B， Jiang P， Zhou X， Lan F， Yi Q， Wu Y.Immuno-modified superparamagnetic nanoparticles via host-guest interactions for high-purity capture and mild release of exosomes. Nanoscale，2018，10（29）：14280-14289.

[7] Konala VB， Mamidi MK， Bhonde R， Das AK， Pochampally R， Pal R.The current landscape of the mesenchymal stromal cell secretome： a new paradigm for cell-free regeneration. Cytoth-erapy，2016，18（1）：13-24.

[8] Ban JJ， Lee M， Im W， Kim M.Low pH increases the yield of exosome isolation. Biochem Biophys Res Commun，2015，461（1）：76-79.

[9] Théry C， Ostrowski M， Segura E. Membrane vesicles as conv-eyors of immune responses. Nat Rev Immunol， 2009， 9（8）：581-593.

[10] van Weering JR， Brown E， Sharp TH， Mantell J， Cullen PJ， Verkade P. Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol，2010，96：619-648.

[11] Février B， Raposo G. Exosomes： endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol，2004，16（4）：415-421.

[12] Sahoo S， Klychko E， Thorne T， Misener S， Schultz KM， Millay M， Ito A， Liu T， Kamide C， Agrawal H， Perlman H， Qin G， Kishore R， Losordo DW. Exosomes from human CD34（+） stem cells mediate their proangiogenic paracrine activity. Circ Res，2011，109（7）：724-728.

[13] Coumans FA， van der Pol E， B?ing AN， Hajji N， Sturk G， van Leeuwen TG， Nieuwland R. Reproducible extracellular vesicle size and concentration determination with tunable resistive pulse sensing. J Extracell Vesicles，2014，3：25922.

[14] van der Pol E， van Gemert MJ， Sturk A， Nieuwland R， van Leeuwen TG. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. J Thromb Haemost，2012，10（5）：919-930.

[15] Ostrowski M， Carmo NB， Krumeich S， Fanget I， Raposo G， Savina A， Moita CF， Schauer K， Hume AN， Freitas RP， Goud B， Benaroch P， Hacohen N， Fukuda M， Desnos C， Seabra MC， Darchen F， Amigorena S， Moita LF， Thery C. Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nat Cell Biol，2010，12（1）：19-30; sup pp 1-13.

[16] Lugini L， Cecchetti S， Huber V， Luciani F， Macchia G， Spadaro F， Paris L， Abalsamo L， Colone M， Molinari A， Podo F， Rivoltini L， Ramoni C， Fais S. Immune surveillance prope-rties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol，2012，189（6）：2833-2842.

[17] Tian T， Zhu YL， Zhou YY， Liang GF， Wang YY， Hu FH， Xiao ZD. Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem，2014，289（32）：22258-22267.

[18] Roberts-Dalton HD， Cocks A， Falcon-Perez JM， Sayers EJ， Webber JP， Watson P， Clayton A， Jones AT. Fluorescence labelling of extracellular vesicles using a novel thiol-based stra-tegy for quantitative analysis of cellular delivery and intracellular traffic. Nanoscale，2017，9（36）：13693-13706.

[19] van der Pol E， Coumans FA， Grootemaat AE， Gardiner C， Sargent IL， Harrison P， Sturk A， van Leeuwen TG， Nieuwland R. Particle size distribution of exosomes and microvesicles deter-mined by transmission electron microscopy， flow cytometry， nanoparticle tracking analysis， and resistive pulse sensing. J Thromb Haemost，2014，12（7）：1182-1192.

（收稿日期：2019-05-18）

（本文編輯：楊江瑜）