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    肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)的初步結(jié)果分析

    2019-10-20 09:48:10姚佳
    關(guān)鍵詞:差異基因選擇性肝細(xì)胞

    姚佳

    【摘? 要】目的:通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,從而對(duì)肝細(xì)胞肝癌的基因組的異質(zhì)性和生物學(xué)機(jī)制有一個(gè)更加全面的理解。方法:對(duì)10例肝細(xì)胞肝癌患者,對(duì)癌及癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果:每個(gè)樣本大量的表達(dá)差異的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(范圍為54到69)和差異表達(dá)的基因(范圍為2971到6910)。共2873個(gè)具有明顯表達(dá)差異的基因,其中上調(diào)1666個(gè),下調(diào)1207個(gè)(差異基因標(biāo)準(zhǔn):FDR<0.001, Foldchang≥2, 存在于5對(duì)樣本以上)。對(duì)差異基因的功能分析結(jié)果顯示:差異基因主要集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附、脂代謝和炎癥等功能類(lèi)和PPRA、P450的代謝、P53和DNA的復(fù)制等信號(hào)通路。此外,每個(gè)樣本發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤特異性突變,其中22.2%位于基因的編碼區(qū),大部分(42.6%)為T(mén):A >C:G這一類(lèi)型的突變。結(jié)論:對(duì)差異基因的分析顯示主要集中于細(xì)胞周期、PPRA和P53等信號(hào)通路,表明這些信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。對(duì)于腫瘤特異性突變的分析,高頻的T:A >C:G這一突變類(lèi)型的發(fā)生,我們推測(cè)基因突變主要發(fā)生在RNA編輯這一過(guò)程中,這表明RNA編輯對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展有相當(dāng)大的影響。大量的新的基因事件的發(fā)生,說(shuō)明肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制比以往的理解更為復(fù)雜。

    【關(guān)鍵詞】肝癌;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;RNA編輯

    【中圖分類(lèi)號(hào)】R158????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????? 【文章編號(hào)】1004-7484(2020)09-0288-02

    肝細(xì)胞肝癌占了原發(fā)性肝臟腫瘤的80—90%,居全世界腫瘤發(fā)病率的第五位,腫瘤相關(guān)性死亡的第三位[1]。肝細(xì)胞肝癌是一種具有高度侵襲性的腫瘤,盡管采用了以手術(shù)切除為主的一系列綜合治療手段,但是肝癌患者的長(zhǎng)期生存率仍然較低[2-3]。肝細(xì)胞肝癌是一種異質(zhì)性疾病,由于基因、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組水平的改變,使得肝細(xì)胞肝癌的形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)多樣性[4] 這些遺傳多樣性嚴(yán)重影響了肝癌的診斷、治療及預(yù)后。

    對(duì)于肝細(xì)胞肝癌分子水平的轉(zhuǎn)錄組研究成為了近年研究的熱點(diǎn),并且對(duì)于進(jìn)一步篩選肝癌診斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子、揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和尋找新的靶向治療位點(diǎn)顯示出了不可估量的潛力。本研究圍運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù),對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行深入測(cè)序,以尋找新的肝癌診斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子和通路,對(duì)肝細(xì)胞肝癌的分子生物學(xué)機(jī)制有一個(gè)更加全面和深入的理解為目標(biāo)。

    1方法及材料:

    1.1 收集本院 2015 年 1 月至 2018 年 12月接受肝癌肝切手術(shù)的男性病人,均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性HCC,且均為HBV相關(guān)性肝癌,無(wú)合并HCV等其他肝炎病毒感染。臨床病理學(xué)資料完整,包括年齡、性別、術(shù)前AFP水平、有無(wú)血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分化分級(jí)、腫瘤大小、數(shù)目等。術(shù)前均未行抗腫瘤治療,手術(shù)切除的組織立即冷凍于-80 ℃以用于提取RNA。

    1.2 主要試劑:美國(guó)Invitrogen 公司Trizol總RNA提取試劑;上海生工生物工程有限公司 DEPC、瓊脂糖;美國(guó)Illumina公司DNase I,oligo(dT),fragmentation buffer,random hexamers,緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I,polyA, QiaQuick PCR試劑盒;其他化學(xué)試劑:氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、甲醇、等均為國(guó)產(chǎn)分析試劑。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法:

    1.3.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序:RNA-Seq 由深圳華大基因公司所做,簡(jiǎn)要步驟如下: 分別提取樣本的總RNA,使用 DNase 消化 DNA 后富集mRNA,用打斷試劑將mRNA打斷成短片段并以此為模板合成 cDNA, 使用試劑盒純化雙鏈 cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加 A 尾, 連接接頭后選擇合適的片段大小進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建好的文庫(kù)用 Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)檢合格后,使用 Illumina HiSeqTM 2500 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,上樣量為 50 ng。

    1.3.2測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及處理

    測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)為raw data,接下來(lái)數(shù)據(jù)處理的步驟:(1)去除含adaptor的reads;(2)去除N的比例大于5%的reads;(3)去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q≤15的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上)。得到Clean data后,我們使用MAQ 軟件將clean reads 與參考序列進(jìn)行比對(duì),每個(gè)read的堿基錯(cuò)配不能大于5個(gè)。

    1.3.3差異表達(dá)基因(DEGS)的篩選

    對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)分析,基因表達(dá)量使用 FPKM( Fragments Per kb per Million reads) 方法計(jì)算,以校正的 P 值( false discovery rate, FDR) ≤0. 05、差

    異倍數(shù)的對(duì)數(shù)絕對(duì)值( ︱log2FoldChange︱,︱FC︱) ≥2為閾值,篩選癌和癌旁的DEGS。1.3.4 差異表達(dá)基因的 GO 分析和 KEGG 富集篩選出 DEGs 后,我們對(duì) DEGs 進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析。

    2結(jié)果:

    2.1 表達(dá)差異:(圖1)

    我們選擇10例肝癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq),10對(duì)樣本平均生成26 355 902 (range: 25 580 346-27 540 350) reads和2.37(range: 2.30-2.48)Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)。采用MAQ軟件,平均92.76% (range: 89.37-97.02%)的reads能夠比對(duì)到人類(lèi)基因組(UCSC version hg19)。通過(guò)比對(duì)腫瘤及其配對(duì)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄本,我們篩選到每對(duì)肝癌樣本中具有表達(dá)差異的基因(2971 to 6910)。

    2.2差異基因及GO和pathway分析

    通過(guò)將10對(duì)樣本的read比對(duì)到基因組后,計(jì)算他們的表達(dá)量,用RPKM來(lái)衡量他們的表達(dá)量。通過(guò)將癌和癌旁組織的RPKM值進(jìn)行比較,計(jì)算他們的表達(dá)差異。將10對(duì)樣本的差異基因進(jìn)一步按以下條件篩選:FDR ≤ 0.001,foldchang≥ 2,上調(diào)或者下調(diào)在5對(duì)樣本以上。共獲得2873個(gè)基因,隨后進(jìn)行GO和pathway的分析,結(jié)果表明,差異基因主要集中于細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞粘附、類(lèi)固醇及脂類(lèi)代謝、依賴于DNA的修復(fù)及炎癥免疫反應(yīng)等功能類(lèi)和P53、細(xì)胞周期,PPRA,DNA修復(fù)等信號(hào)通路,具體結(jié)果見(jiàn)圖2及表1。隨后對(duì)于10對(duì)樣本中一致上調(diào)或下調(diào)的106個(gè)基因進(jìn)行聚類(lèi),見(jiàn)圖3

    2.3 SNP及腫瘤特異性突變:

    每個(gè)肝癌樣本平均找到12909(范圍為6877-27970)個(gè)腫瘤特異性點(diǎn)突變,這些突變位點(diǎn)22.2%位于基因編碼區(qū)域(CDS區(qū)),其中946個(gè)為非同義突變。其中42.6%為T(mén):A >C:G(圖4)。

    討論:

    從分子生物學(xué)的角度講,肝癌和其他腫瘤一樣,是一種復(fù)雜的疾病[4-5]。過(guò)去的幾十年的研究已經(jīng)證明,基因的改變?cè)诟伟┑陌l(fā)生發(fā)展因此起著重要的作用[6-8]。對(duì)于肝癌的基因?qū)W特征的更加詳細(xì)的了解,能夠促進(jìn)肝癌在診斷,治療及預(yù)后等方面發(fā)展。本研究中,我們對(duì)10例肝癌及其癌旁組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過(guò)這些數(shù)據(jù)及聯(lián)合分析,我們首先分析了腫瘤及癌旁組織基因的表達(dá)差異,其中有很多基因已經(jīng)被證實(shí)與肝癌的發(fā)生有關(guān),例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)[9-11]。同樣,也發(fā)現(xiàn)了很多新的未被注釋的基因被找到,這說(shuō)明基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)尋找表達(dá)差異的基因是一種更加高效的研究方式。在這些信號(hào)通路中,大部分已經(jīng)被報(bào)道證實(shí)與肝癌的發(fā)展具有密切的關(guān)系,例如細(xì)胞周期的信號(hào)通路、P53、PPAR等[12]。同時(shí),差異基因在一些基本的代謝途徑中被富集,例如,類(lèi)固醇的代謝、脂肪酸的代謝。特別有趣的是,細(xì)胞色素P450這一信號(hào)通路,許多該家族的基因在肝癌組織中明顯的下調(diào),這與先前關(guān)于肝癌組織中細(xì)胞色素P450分子的活性降低及低表達(dá)相一致[13]??偠灾?,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示肝癌的發(fā)生涉及到多條關(guān)鍵的細(xì)胞通路,包括細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的通路,代謝相關(guān)的過(guò)程及免疫相關(guān)的調(diào)劑通路。

    人類(lèi)的基因是由多個(gè)外顯子中穿插著內(nèi)含子來(lái)構(gòu)成。初級(jí)轉(zhuǎn)錄本RNA通過(guò)RNA的剪切的過(guò)程,內(nèi)含子被去除,成為一個(gè)成熟的mRNA.通過(guò)選擇性剪切的機(jī)制,一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本能夠生成多個(gè)mRNA[14]。RNA的選擇性剪切起著重要的生物功能,例如膜結(jié)合蛋白IgM和分泌蛋白IgD 是由同一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過(guò)選擇性剪接所產(chǎn)生[15]。已有許多基于基因組的基礎(chǔ)上,對(duì)于RNA選擇性剪切的研究,這些研究表明人類(lèi)35-39%的基因至少有一個(gè)選擇性剪切異構(gòu)體[16-19]。一些研究顯示,RNA選擇性剪切頻繁的發(fā)生于腫瘤相關(guān)的基因,例如EGFR,CD44,NER[20-22]。本研究基于基因組學(xué)的基礎(chǔ)上,尋找與肝癌相關(guān)的選擇性剪切事件,作為肝癌診斷的一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物。突變位點(diǎn)22.2%位于基因編碼區(qū)域(CDS區(qū))其中42.6%為T(mén):A >C:G,對(duì)于這一現(xiàn)象,合理的解釋為這種類(lèi)型的點(diǎn)突變發(fā)生在RNA編輯過(guò)程中。RNA編輯過(guò)程中將腺嘌呤(A)改變?yōu)榇吸S嘌呤核苷酸(I),而后次黃嘌呤核苷酸被翻譯為鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(G)[23]

    針對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)了大量的新的基因事件的發(fā)生,包括選擇性剪接、腫瘤特異性突變等,說(shuō)明肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制比以往的理解更為復(fù)雜。這一較為全面的肝癌轉(zhuǎn)錄組水平的研究,為我們進(jìn)一步研究肝癌發(fā)病的分子機(jī)制提供了重要的線索和參考價(jià)值。

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    基金資助:

    2017浙江省教育廳課題(Y201738263)

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