顱腦損傷患者急性期外周血miR-130a、miR-132的表達及其臨床意義

路偉 李鋼 周奮 劉仲海

[摘 要] 目的 探討顱腦損傷（TBI）患者入院時外周血miR-130a和miR-132水平對病情嚴重程度的早期診斷價值，以及對重型顱腦損傷（sTBI）患者發(fā)病6個月預后的預測價值。方法 選擇在我院救治的158例TBI患者和30例健康志愿者作為對照組納入研究，根據(jù)格拉斯昏迷評分（GCS），將TBI患者分為輕度（mTBI）組、中度（msTBI）組和重度（sTBI）組。采用基因芯片技術(shù)篩選四組受試對象有表達差異的miRNAs，并篩選靶基因明確的miRNAs進行熒光定量PCR驗證。隨訪6個月，根據(jù)格拉斯預后評分（GOS），將患者分為預后良好組和預后不良組。建立受試者工作特征（ROC）曲線確定外周血miRNAs對預后診斷的臨界值。結(jié)果 經(jīng)基因芯片分析選擇miR-130a和miR-132作為目標miRNA，經(jīng)熒光定量PCR檢測，與對照組受試者相比，三組TBI患者外周血中miR-130a表達均顯著上調(diào)，同時miR-132表達量顯著下調(diào)（均P<0.05）。而且以sTBI組患者外周血miR-130a水平為最高，miR-132水平為最低。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，TBI患者入院時GCS評分和外周血miR-130a表達呈負相關(guān)性（rs=-0.79，P<0.05），而和miR-132表達呈正相關(guān)性（rs=0.74，P<0.05）。根據(jù)6個月隨訪結(jié)果，39例患者預后良好，26例患者預后不良。預后良好組患者外周血miR-130a水平低于預后不良組患者（P<0.05），同時miR-132水平高于預后不良組患者（P<0.05）。經(jīng)ROC曲線分析，入院時外周血miR-130a和miR-132水平對sTBI患者6個月預后預測的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.74（95%CI 0.57～0.87）、0.70（95%CI 0.63～0.85），差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而miR-130a和miR-132聯(lián)合預測mTBI患者預后的ROC曲線AUC明顯高于單項指標（P<0.05）。結(jié)論 TBI患者入院時外周血miR-130a和miR-132水平可早期評估疾病嚴重程度，并且可作為sTBI患者近6個月預后的早期預測指標。

[關(guān)鍵詞] 重型顱腦損傷;基因芯片;微小RNA-130a;微小RNA-132;近期預后

中圖分類號：R651.1+5? 文獻標識碼：A? 文章編號：1009-816X（2019）04-0299-05

[Abstract] Objective To explore the expression of serum miR-130a and miR-132 in patients with traumatic brain injury （TBI） and the predictive value on short-time （6 months） prognosis of patients with severe traumatic brain injury （sTBI）. Methods 158 TBI patients were divided into mTBI group， msTBI group and sTBI group according to Glasgow coma score，and 30 healthy volunteers were selected as control group. Using gene chip technology to filtrate different miRNAs in four groups ， then miRNAs with target gene were validated by fluorogenic quantitative PCR. According to Glasgow outcome score （GOS） after injury 6 months， TBI patients were divided into patients with good prognosis and patients with poor prognosis. Receiver operating characteristic （ROC） curve was built to analyze the predictive value of serum miRNAs at admission on short-time prognosis of patients. Results Choosing miR-130a and miR-132 as target miRNA through gene chip technology analysis. Validated by fluorogenic quantitative PCR， the expression of miR-130a in mTBI， msTBI， sTBI patients were increased gradually （P<0.05）， and the expression of miR-132in mTBI， msTBI， sTBI patients were declined gradually （P<0.05）. And the sTBI patients had highest level of miR-130a and lowest level of miR-132 than these of mTBI and msTBI patients （all P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that the GCS score and miR-130a was negative related （rs=-0.79，P<0.05）， while GCS score and miR-132 was positive related （rs=0.74，P<0.05）. After followed up 6 months， there were 39 patients with good prognosis and 26 patients with poor prognosis. The level of miR-130a in good prognosis group was lower than that in poor prognosis group， the level of miR-132 in good prognosis group was higher than that in poor prognosis group （P<0.05）. The area under ROC curve of miR-130a and miR-132 at admission on prediction of prognosis of sTBI patients were 0.74 （95% CI： 0.57～0.87） and 0.70 （95% CI： 0.63～0.85）， which was lower than combined predictive value of miR-130a and miR-132 （P<0.05）. Conclusions Serum miR-130a and miR-132 at admission is closely related with the severity of disease， which could be the early sensitive predictors of prognosis in sTBI patients in 6 moths.

[Key words] Severe traumatic brain injury （sTBI）; Gene chip; MiR-130a;MiR-132; Short-time prognosis

重型顱腦損傷（severe traumatic brain injury，sTBI）是重癥監(jiān)護病房收治的最常見的危急重癥之一，起病急，病情進展迅速、死亡率極高[1]。如何對患者病情嚴重程度以及預后迅速做出初步且準確的判斷，并與患者家屬溝通病情以及生存評估是神經(jīng)外科醫(yī)師最為棘手的問題。目前，電子計算機斷層掃描以及磁共振成像可以幫助醫(yī)師了解患者顱內(nèi)腦組織損傷情況，但是尚不能完全準確地評估患者病情嚴重程度[2]。而顱內(nèi)壓、血壓、血氧等指標具有一定的滯后性，易延誤治療時機[3]。因此尋找敏感度和特異度較高且操作便捷的檢測對象，對于完善sTBI的病情監(jiān)測、治療選擇以及預后評估具有重要的臨床價值。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類長度約19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，多數(shù)真核細胞中的miRNAs定位于基因間隔區(qū)，具有高度保守序列[4]。2008年，Mitchell等[5]學者發(fā)現(xiàn)外周血中也存在穩(wěn)定表達的miRNAs，并且不受到核糖核酸酶降解的影響。在本項研究中，首先通過Agilent高通量基因芯片技術(shù)（miRBase V21.0）篩查sTBI患者外周血中的特異性miRNAs表達譜，以尋找可用于sTBI早期診斷和預后的潛在標志分子，同時也為sTBI發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2016年9月至2018年1月期間由我院重癥醫(yī)學科和神經(jīng)外科收治的TBI患者158例，男113例，女45例，年齡18～78歲，平均（57.38±13.45）歲。根據(jù)入院時格拉斯昏迷評分（glasgow coma score，GCS）[6]，13～15分為輕度TBI（mTBI組）共59例;9～12分為中度TBI（msTBI組）共34例;3～8分為重度TBI（sTBI組）共65例。其中，意外交通事故94例，高處下墜傷31例，重物砸傷25例，其他傷害8例。納入標準：（1）年齡≥18歲;（2）損傷后24h內(nèi)入院者;（3）入院后至少接受1次顱腦CT檢查，并證實存在腦挫裂傷并伴發(fā)不同程度的顱內(nèi)血腫和顱骨骨折者。排除標準：（1）創(chuàng)傷前存在顱腦病變者;（2）腹腔、胸腔、四肢等其他部位嚴重損傷導致低血壓和低血氧等主要生命體征異常者;（3）合并高血壓、糖尿病等慢性疾病者，急慢性感染者，肝腎等嚴重功能不全者以及其他嚴重系統(tǒng)性疾病者;（4）近3個月內(nèi)有手術(shù)史、創(chuàng)傷史或者輸血史者。該實驗的所有過程均遵從赫爾辛基宣言標準，該研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準，且在充分告知可能存在的風險后與所有患者家屬簽署了知情同意書。另外選擇同時期在我院健康體檢中心進行體格檢查且完全正常的健康志愿者30例作為對照組，男22例，女8例，年齡24～80歲，平均（58.96±14.37）歲。對照組和TBI組患者年齡和性別組成基本一致，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。

1.2 方法：

1.2.1 血液樣本采集：患者入院后立即采取外周靜脈血3mL置于肝素鈉真空采血管（美國BD公司），另外收集對照組體檢時的血液樣本，室溫靜置20min，1500r/min離心10min（離心半徑8cm），取上清液，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNAs芯片檢測及分析：采用Agilent高通量基因芯片技術(shù)（miRBase V21.0，G4872A），檢測樣本來自于對照組、mTBI組、msTBI組和sTBI組各5例，四組受試對象的年齡、性別組成基本一致，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。按照TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）和mirPremiermicroRNA Isolation Kit（Invitrogen公司，美國）說明書提取外周血miRNA，并采用NanoDrop 1000檢測miRNA的純度。用標記酶Hy3TM熒光標記miRNAs，得到與芯片雜交的熒光探針。

1.2.3 熒光定量PCR：采用TRIzol試劑盒提取外周血總RNA，采用分光光度計檢測RNA濃度。根據(jù)試劑盒說明書操作進行。根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。

1.2.4 sTBI患者的急救方法：sTBI患者接受院前急救和院內(nèi)急救，在受傷現(xiàn)場或運送途中給予呼吸機維持呼吸、外周靜脈補液、壓迫止血和固定等措施。進入重癥監(jiān)護室后，有57例患者接受神經(jīng)外科手術(shù)治療，給予去骨瓣減壓+血腫清除術(shù)或者微創(chuàng)血腫碎吸手術(shù)，腦室出血者進行微創(chuàng)腦室鉆孔外引流;其余8例患者進行保守治療。

1.2.5 sTBI患者的隨訪和預后評估：采用電話、家訪或門診復診方式進行6個月隨訪，對所有患者進行格拉斯預后評分（glasgow outcome score，GOS）[8]，死亡為1分;植物生存為2分;重度病殘，意識清楚但生活不能自理為3分;中度病殘，生活能自理為4分;恢復良好，正常生活但有輕度神經(jīng)障礙為5分。GOS≤3分為預后不良，>3分為預后良好。

1.3 統(tǒng)計學處理：將資料輸入SPSS17.0版統(tǒng)計學軟件進行處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x -±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。建立受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定miRNA對sTBI的預后預測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

本文還發(fā)現(xiàn)外周血miR-130a和miR-132水平與6個月預后有關(guān)。這主要與顱腦損傷過程中伴有的炎癥反應(yīng)有關(guān)。既往有學者通過細胞實驗提出，miR-130a屬于血管新生中靶向抑制血管新生轉(zhuǎn)錄因子、生長抑制特異性同源框蛋白GAX以及HOXA5蛋白的miRNA，與腦組織損傷后腦血腫的形成有關(guān)[13]。有學者通過動物實驗證實，血清中miR-130a的表達量與腦血腫周圍腦組織中miR-130a的表達量一致，是反映腦水腫程度的重要指標[14]。而miR-132分子已經(jīng)被證實可以靶向抑制乙酰膽堿酯酶的表達和活性，從而增加乙酰膽堿的水平以及其抗炎作用。另外，miR-132在腦組織的發(fā)育、樹突細胞的起源、突觸形成和成熟中均發(fā)揮重要的促進作用[15]。因此血清中miR-132含量的高低也是反應(yīng)TBI患者腦組織炎癥反應(yīng)的重要指標?；谏鲜鰴C制分析，本文通過ROC曲線證實，入院時sTBI患者外周血miR-130a和miR-132水平對sTBI患者預后預測的ROC曲線下面積基本一致，差異無統(tǒng)計學意義，但是聯(lián)合這兩項指標的預測價值較高。

綜上所述，入院時外周血miR-130a和miR-132水平檢測有望成為早期評估TBI患者疾病嚴重程度，并及時預估近6個月預后的重要指標，對于現(xiàn)有的疾病監(jiān)測和預后預測系統(tǒng)進行了一定的補充，有一定的臨床價值。

參考文獻

[1]袁杰，霍春芬.重型顱腦損傷術(shù)后患者預后現(xiàn)狀和影響因素分析[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（1）：3-6.

[2]Qualls D， Leonard JR， Keller M， et al. Utility of magnetic resonance imaging in diagnosing cervical spine injury in children with severetraumatic brain injury[J]. J Trauma Acute Care Surg，2015，78（6）：1122-1128.

[3]Banoei MM， Casault C， Metwaly SM， et al. Metabolomics and biomarker discovery in traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2018，35（16）：1831-1848.

[4]Di Pietro V， Ragusa M， Davies D， et al. MicroRNAs as novel biomarkers for the diagnosis and prognosis of mild and severe traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma， 2017， 34（11）：1948-1956.

[5]Mitchell PS， Parkin RK， Kroh EM， et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（30）：10513-10518.

[6]王小剛，高丁，李濤，等.院前應(yīng)用格拉斯哥昏迷分級評分評估顱腦損傷患者與預后的相關(guān)性分析[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2015，43（8）：36-39.

[7]李春偉，伊志強，李良.重型創(chuàng)傷性顱腦損傷的治療進展[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2016，20（7）：656-660.

[8]秦燕，周順科，劉軍.多種MRI技術(shù)在輕型顱腦損傷中的應(yīng)用研究進展[J].磁共振成像，2015，6（3）：235-240.

[9]周小龍，宋建榮，呂新文，等.miR-93、miR-191、miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達及其臨床意義[J].卒中與神經(jīng)疾病，2016，23（6）：399-403.

[10]馬永盛，陳亮，衣蘭凱.GCS和ICS及APACHEⅡ三種臨床評分對昏迷患者的預后評估[J].中國全科醫(yī)學，2008，11（1）：1761-1762.

[11]Deepika A， Devi BI， Shukla D， et al. Neuroimmunology of traumatic brain injury： a longitudinal study of interdependency of inflammatory markers and heart rate variability in severe traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2018，35（10）：1124-1131.

[12]陳吉鋼，張丹楓，魏嘉良，等.創(chuàng)傷性眶上裂綜合征的治療[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2016，21（4）：200-202.

[13]Chen Y， Gorski DH. Regulation of angiogenesis through a microRNA （miR-130a） that down-regulates antiangiogenic homeobox genes GAX and HOXA5[J]. Blood，2008，111（3）：1217-1226.

[14]Wang Y， Wang MD， Xia YP， et al. MicroRNA-130a regulates cerebral ischemia-induced blood brain barrier permeability by targeting Homeobox A5[J]. FASEB J，2018，32（2）：935-944.

[15]Che F， Du H， Zhang W， et al. MicroRNA-132 modifies angiogenesis in patients with ischemic cerebrovascular disease by suppressing the NFκB and VEGF pathway[J]. Mol Med Rep，2018，17（2）：2724-2730.