DGGE法分析醬菜中酵母菌多樣性

燕平梅,魏愛麗，陳燕飛,趙文婧

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619;2.太原師范學(xué)院土壤消毒活化 綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

蔬菜醬制這一加工蔬菜的方法在我國由來已久。由于制作方法簡單易學(xué)，原料可以直接從當(dāng)?shù)孬@得，因此在我國許多地方形成了獨具風(fēng)味的產(chǎn)品。醬菜是常見的發(fā)酵食品之一，醬菜的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵的工藝。從發(fā)酵醬菜的體系中分離出的微生物有細菌、酵母菌和霉菌類等。其中細菌類的代表菌株是胚芽乳酸桿菌、短桿菌，酵母菌類的代表菌株是假絲酵母、醬油酵母，霉菌類的代表菌株是青霉、白地霉等[1,2]。醬菜不僅可以調(diào)節(jié)口味，還具有促進腸道消化吸收的作用[3，4]。

研究醬菜中酵母菌多樣性的方法有培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法。由于培養(yǎng)法在實際操作過程中工作量大且繁瑣，故更多的人選擇非培養(yǎng)法來研究體系中微生物的多樣性。 其中培養(yǎng)法包括磷脂脂肪酸法、生理方法的鑒定系統(tǒng)和分子生物學(xué)方法[5]。近年來，分子生態(tài)學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，受到了廣大科研工作者的喜愛。該技術(shù)主要通過分析微生物的基因序列信息研究發(fā)酵體系中微生物的多樣性與功能性[6]。其中DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技術(shù)更是得到了廣泛的應(yīng)用。DGGE技術(shù)是由Fischer和Lerman率先提出的[7]。1993年，Muyzer等[8]首次將其應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究。目前，DGGE技術(shù)被廣泛用于環(huán)境微生態(tài)方面的研究。2015年，趙柏霞等用PCR-DGGE技術(shù)研究接種了枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌群落的變化，發(fā)現(xiàn)接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌的數(shù)量及種類發(fā)生了較大變化[9]。呂文洲等[10]的研究結(jié)果表明，PCR-DGGE技術(shù)用于解析油脂廢水系統(tǒng)中酵母菌群落結(jié)構(gòu)的可行性。張先琴等[11]用PCR-DGGE技術(shù)分析了四川地區(qū)家庭制作泡菜中微生物的多樣性，結(jié)果表明細菌的種類較豐富，而真菌的種類較少。本實驗以兩種市售的醬菜樣品為實驗材料，采用PCR-DGGE技術(shù)探究醬菜中酵母菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

3袋袋裝小青瓜(原料∶青瓜)和3袋袋裝醬黃瓜(原料∶青瓜)的混合醬菜，以JA表示；散裝醬菜(原料：黃瓜和青瓜)，以JB表示。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒：索萊寶生物有限公司；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、去離子甲酰、過硫酸銨、尿素(均為分析純)：美國AMRESCO公司；2×Taq Master Mix、DH5a感受態(tài)細胞：天根生物技術(shù)有限公司；引物：由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-96(G)H(b)B Life Touch基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；DcodeTM凝膠成像系統(tǒng)、DcodeTM濃度梯度電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 醬菜中微生物基因組DNA的提取

將袋裝醬菜編號為JA，散裝黑色醬菜編號為JB。首先用滅菌濾紙對醬菜汁進行過濾。兩種醬菜汁各取18 mL于9支2 mL的離心管中，8000 r離心5 min。倒盡上清液，收集沉淀，再次離心，倒盡上清液。使用DNA提取試劑盒提取DNA，1%的瓊脂糖凝膠檢測，于-20 ℃保存。

1.3.2 26S rDNA的PCR擴增

在引物合成公司合成擴增所需的上游引物與下游引物。

上游引物為NL1-GC(cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)；

下游引物為LS2(att ccc aaa caa ctc gac tc)。

反應(yīng)體系:PCR Master 12.5 μL，每種引物1 μL，微生物總DNA 1.5 μL，加ddH2O至25 μL。

1.3.3 PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 Formula of denaturing gradient gel

DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應(yīng)擴增26S rDNA 片段，純化后與pGM-T Vector進行連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。將檢測陽性克隆的樣品送到華大基因公司進行基因序列測定。

1.3.4 DGGE圖譜分析

使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜。

計算多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)。

計算公式：

多樣性指數(shù)(H)[12]的計算公式：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)，E=H/InS，R=S-1/InN。

式中：ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數(shù)。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析方法

將測序結(jié)果提交到NCBI中進行比對，通過MEGA 6.0利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果及分析

2.1 提取DNA的電泳分析

DNA提取后的電泳檢測結(jié)果和PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。

圖1 基因組DNA(左)及PCR(右)電泳圖Fig.1 Genomic DNA (left) and PCR (right) electrophoretogram

注：JA表示袋裝醬菜，JB表示散裝醬菜，M表示Marker。

由基因組DNA電泳圖1(左)中可知，JA樣品與JB樣品的DNA條帶無非特異帶，能夠進行PCR擴增反應(yīng)。 由圖1(右)可知，樣品DNA片段大小約為270 bp。擴增產(chǎn)物條帶清晰，因此可以做DGGE實驗。

2.2 變性梯度凝膠電泳結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物 DGGE 凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。

圖2 DGGE 電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoretogram

由DGGE圖譜可知，凝膠圖譜中條帶的位置、粗細以及亮暗程度有一定的差異。JA樣品有3個條帶，分別是JA-2、JA-1、JA-3，表明JA樣品有3種酵母菌。JB樣品有2個條帶，分別是JB-1、JB-2，表明JB樣品有兩種酵母菌。其中JA-1和JB-1、JA-3和JB-2位置一致，表明兩個樣品中有同種酵母菌。JA-2較粗較亮，說明該種酵母菌含量較高。

2.3 醬菜微生物26S rDNA片段的DGGE圖譜分析

2.3.1 醬菜微生物群落結(jié)構(gòu)特征

使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜可知(見表2)，JA樣品與JB樣品的均勻度指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。JA樣品的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著大于JB樣品(P<0.05)，表明JA樣品的酵母菌種類較豐富。

表2 酵母菌微生物群落結(jié)構(gòu)特征Table 2 Structural characteristics of yeast microbial community

2.3.2 醬菜不同發(fā)酵時間酵母菌類型的聚類分析

運用Quantity One軟件的“phylogenetic analysis”方式，根據(jù)UWPGA算法對兩種醬菜酵母菌群落結(jié)構(gòu)進行相似性聚類分析。由圖3可知，兩種醬菜樣品的酵母菌群落結(jié)構(gòu)聚于一個大分支。

圖3 兩種醬菜26S rDNA 片段的DGGE條帶 相似性聚類圖Fig.3 DGGE band similarity clustering map of 26S rDNA fragments of two kinds of pickles

2.3.3 DGGE回收電泳帶的鑒定

為了研究發(fā)酵醬菜體系中優(yōu)勢的微生物種類，實驗中回收熒光強度強、不同時間差異的電泳帶，通過基因擴增反應(yīng)后測定堿基序列,與GenBank 庫序列對比鑒定。發(fā)酵醬菜樣品DGGE條帶序列結(jié)果見表3。

表3 醬菜酵母菌的DGGE條帶序列結(jié)果Table 3 DGGE band sequencing results of yeasts in pickles

電泳條帶JA-2、JB-1、JB-2分別與Pichiafermentans(乳源酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)的菌株相似，相似度約為88%、98%、98%。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用MEGA 6.0軟件利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統(tǒng)發(fā)育樹，對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析，見圖4。

圖4 醬菜樣品中酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeasts in pickle samples

3 結(jié)論

本實驗以兩種市售醬菜為研究對象，通過PCR-DGGE方法分析了這兩種醬菜中酵母菌的多樣性。發(fā)現(xiàn)樣品JA比樣品JB的酵母菌種數(shù)大，發(fā)酵醬菜中的酵母菌總共有3個屬，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)為優(yōu)勢菌種。兩個樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異。2011年，高秀芝等[13]用PCR-DGGE法分析了天源醬園豆醬發(fā)酵過程中微生物多樣性。研究表明，發(fā)酵過程中主要的細菌優(yōu)勢種是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和未培養(yǎng)明串珠克隆(UnculturedLeuconostocsp. clone)，主要的真菌優(yōu)勢種是米曲霉(Aspergillusoryzae)。2014年烏日娜等[14]用PCR-DGGE法分析了東北自然發(fā)酵酸菜中的生物多樣性。結(jié)果表明，酸菜中的真菌種類比較少，細菌種類較多。主要的真菌菌種有漢遜德巴利(Debaryomyceshansenii)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等。

培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法二者都可以用來研究發(fā)酵體系微生物的多樣性。培養(yǎng)法是通過配制滿足目的微生物基本生長需求的培養(yǎng)基，使目的微生物在培養(yǎng)基上生長與繁殖的方法，這種方法可能會出現(xiàn)在發(fā)酵體系中大量存在的微生物在培養(yǎng)基上無法正常培養(yǎng)或生長的情況，導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此更多的人選擇工作量小且能夠較真實地反映發(fā)酵體系中微生物多樣性的非培養(yǎng)法[15]，即基于PCR的DGGE技術(shù)。2008年， Chang Ho-Won等[16]用PCR-DGGE技術(shù)研究細菌、古細菌和酵母在不同類型泡菜中的發(fā)酵動力學(xué)。根據(jù)DGGE的原理，該方法可以分離長度相同但堿基序列不同的DNA片段。 DGGE圖譜中條帶的位置、數(shù)量和亮暗程度可以反映出樣品中微生物多樣性的信息[17]。