長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)孕中期小鼠胚胎發(fā)育的影響

孫麗萍，張靖楠，李小娟，張 蓓，楊利國(guó)

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 河南鄭州 450002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070）

運(yùn)輸會(huì)引起動(dòng)物生理生化功能的改變，尤其是長(zhǎng)途運(yùn)輸。在卵泡期，運(yùn)輸引起下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活顯著推遲了促黃體生成素（LH）峰值[1-3]。運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)羔羊均只獲卵數(shù)、均只獲可用卵數(shù)及均只獲可用卵率均無(wú)顯著影響[4]，但進(jìn)行6 h 的道路運(yùn)輸后海蘭褐雞卵巢雌二醇受體mRNA 和孕酮受體mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低[5]。產(chǎn)前運(yùn)輸應(yīng)激并沒有影響垂體對(duì)GnRH的反應(yīng)及睪丸對(duì)GnRH 誘導(dǎo)的LH 分泌[6]。對(duì)妊娠3 d的小鼠進(jìn)行連續(xù)束縛應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)胚泡著床位點(diǎn)數(shù)和子宮蛻膜中的胚泡數(shù)目顯著減少[7]。

排卵、性行為表現(xiàn)、胚胎著床、分娩和斷奶是繁殖過程最敏感的時(shí)期，這些過程均受內(nèi)分泌系統(tǒng)的控制。小鼠胚胎發(fā)育至14 d（E14）時(shí)內(nèi)胚細(xì)胞開始分化形成3 個(gè)胚層，此時(shí)胚胎對(duì)環(huán)境條件十分敏感[8]?；诖?，本試驗(yàn)選擇對(duì)環(huán)境較敏感的妊娠中期（懷孕8～10 d）小鼠來(lái)研究運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)胚胎發(fā)育的影響，旨在探討運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)妊娠的影響程度和影響方式，通過Agilent 小鼠表達(dá)譜芯片篩選運(yùn)輸前后垂體和子宮中的差異表達(dá)基因，以期找到抗運(yùn)輸應(yīng)激的主效基因及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為抗運(yùn)輸應(yīng)激新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品的采集 8 周齡健康清潔級(jí)昆明雌鼠100 只，9～10 周齡健康昆明雄鼠50 只。試驗(yàn)動(dòng)物、動(dòng)物飼料和墊料購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫控制在22℃左右，光控時(shí)間為07:00—19:00，自由采食、飲水和活動(dòng)，預(yù)試1 周后進(jìn)入正式試驗(yàn)。于每天17:00 開始按2:1 的比例進(jìn)行雌雄鼠合籠配種，第2 天07:00—08:00 查栓，見栓當(dāng)天記為妊娠第0 天，連續(xù)配種3 d。隨機(jī)取孕8～10 d 小鼠14 只進(jìn)行 1 000 km 的普通公路長(zhǎng)途運(yùn)輸（時(shí)間約15 h），運(yùn)輸過程中不間斷飲水、采食和活動(dòng)。

運(yùn)輸結(jié)束后隨機(jī)取孕8～10 d 試驗(yàn)鼠和正常對(duì)照鼠各3 只，頸椎脫臼致死，快速取垂體和胎盤，生理鹽水沖洗后投入液氮速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。其余孕鼠分別于運(yùn)輸結(jié)束后2～3 d 頸椎脫臼致死，并記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)，計(jì)算活胎率、死胎率和吸收胎率：

活胎率=活胎仔數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

吸收胎率=（早期吸收數(shù)+晚期吸收率）/胎仔總數(shù)×100%

死胎率=死胎數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

1.2 總RNA 的提取 采用Trizol 一步法提取總RNA（Cat#15596-018,Life technologies,Carlsbad，CA，US）。抽提所得總RNA 經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent technologies,Santa Clara，CA，US）電泳質(zhì)檢合格后使用RNeasy mini kit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）和 RNase-Free DNase Set（Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany），純化total RNA。

1.3 芯片雜交和掃描 質(zhì)檢合格的RNA 樣品采用干冰送上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行mRNA 放大和標(biāo)記，用RNeasy mini kit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）純化標(biāo)記后的cRNA，之后按照Agilent 表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒進(jìn)行Agilent 小鼠全基因4×44K 芯片雜交。

完成雜交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565CA，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）進(jìn)行掃描，軟件設(shè)置Dye channel:Green，Scan resolution=5 μm，PMT 100%，10%，16bit。用Feature Extraction software 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 11.0（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.4 QPCR 驗(yàn)證基因芯片 為了證明基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確程度，本試驗(yàn)選取了5 個(gè)差異基因，設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR 引物（表1），以β-action為內(nèi)參，采用SYBR Green I 熒光染料，在Bio-Rad IQ5 Real-time PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用IQR 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，然后采用moderate t-test 篩選差異倍數(shù)大于2 倍的基因。采用Westfall Young 來(lái)剔除假陽(yáng)性。篩選到的差異表達(dá)基因上傳入Ingenuity Pathway Analysis（IPA）V7.5 軟件，進(jìn)行分子功能和基因網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)孕鼠胚胎發(fā)育的影響 由表2 可知，與對(duì)照組相比，孕中期長(zhǎng)途運(yùn)輸導(dǎo)致活胎率顯著下降和死胎率顯著增加。

表1 用于定量PCR 驗(yàn)證的引物

2.2 陣列和通路分析 在孕中期垂體中篩選到了138 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中71 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，67 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。在孕中期子宮中篩選到了392 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中73 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，319 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。表3 和表4 列出了與正常對(duì)照相比孕中期小鼠垂體和子宮組織中運(yùn)輸應(yīng)激差異最為顯著的10 個(gè)基因的信息。

差異基因的IPA 分析發(fā)現(xiàn)，典型通路和生物功能涉及免疫和炎性疾病、細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞間的相互作用、機(jī)能失調(diào)等（表5 和表6）。其中垂體中磷脂酰膽堿生物合成和DHA 信號(hào)通路及子宮中自然殺傷細(xì)胞通路都對(duì)胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)發(fā)揮著非常重要的作用。

IPA 分析出垂體中的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：①RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能、細(xì)胞間信號(hào)和相互作用（score 35，24 個(gè)主要分子）；②體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期（score 33，23 個(gè)主要分子）；③心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心肌肥大（score 30，22 個(gè)主要分子）；④體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞形態(tài)（score 29，21 個(gè)主要分子）；⑤分子運(yùn)輸、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖（score 27，20 個(gè)主要分子）。IPA 分析出子宮中的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：①細(xì)胞死亡和存活、感染性疾病、炎性反應(yīng)（score 43，26 個(gè)主要分子）；②細(xì)胞功能與維持、血液系統(tǒng)發(fā)育和功能、細(xì)胞間信號(hào)和相互作用（score 31，20 個(gè)主要分子）；③細(xì)胞間信號(hào)和相互作用、組織發(fā)育（score 31，20 個(gè)主要分子）；④發(fā)育畸形、遺傳性疾病、代謝性疾病（score 31，20 個(gè)主要分子）；⑤脂代謝、分子運(yùn)輸、小分子生物合成（score 30，20 個(gè)主要分子）。

表2 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)孕中期鼠胎兒發(fā)育的影響

表3 應(yīng)激組和對(duì)照組相比垂體組織中前10 個(gè)差異表達(dá)基因

表4 應(yīng)激組和對(duì)照組相比子宮組織中前10 個(gè)差異表達(dá)基因

表5 垂體組織中差異基因的典型信號(hào)通路（P＜0.0001）

從表7 和表8 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可以看出，經(jīng)歷長(zhǎng)途運(yùn)輸后孕鼠無(wú)論是垂體還是子宮組織都有重復(fù)的基因參與不同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且部分基因不僅參與運(yùn)輸應(yīng)激垂體中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還參與子宮中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如Fcer1、Igg3、IgG2a、PLC gamma、SYK/ZAP 既參與垂體中體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期，又在子宮中參與細(xì)胞功能與維持、血液系統(tǒng)發(fā)育和功能、細(xì)胞間信號(hào)和相互作用。IFN alpha/beta 和NFkB（complex）既參與垂體中體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又參與子宮中細(xì)胞間信號(hào)和相互作用、組織發(fā)育調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)。ARID3A、BCR（complex）、Ige、IgG1 既 參與垂體中體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞形態(tài)又參與子宮中細(xì)胞功能與維持、血液系統(tǒng)發(fā)育和功能、細(xì)胞間信號(hào)和相互作用。Alpha catenin、Collagen type I、creatine kinase、Laminin、Notch 既參與垂體中分子運(yùn)輸、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，又參與子宮中細(xì)胞間信號(hào)和相互作用、組織發(fā)育。Jnk 和Ldh 既參與垂體中體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞形態(tài)，又在運(yùn)輸應(yīng)激小鼠子宮中參與脂代謝、分子運(yùn)輸、小分子生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

表6 垂體和子宮組織中差異基因的主要生物功能（P＜0.0001）

本研究還發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸應(yīng)激子宮組織中OLR1 和WNT10A 既參與細(xì)胞間信號(hào)的相互作用、組織發(fā)育又參與發(fā)育畸形、遺傳性疾病、代謝性疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而AMBP基因既參與發(fā)育畸形、遺傳性疾病、代謝性疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，又參與脂代謝、分子運(yùn)輸、小分子生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.3 基因芯片結(jié)果的定量驗(yàn)證 為了驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，試驗(yàn)選擇了部分差異顯著性的基因進(jìn)行了驗(yàn)證。熒光定量PCR 得到的差異倍數(shù)與芯片結(jié)果得出的差異倍數(shù)不盡相同（表9）?？赡芘c定量PCR 方法和基因芯片方法精確度不同、2 種方法的動(dòng)態(tài)范圍存在差異以及芯片不能特異區(qū)分一個(gè)基因家族的單個(gè)基因有關(guān)，然而2 種方法得到的基因表達(dá)模式一致。這表明熒光定量PCR 技術(shù)和基因芯片所得擴(kuò)增產(chǎn)物的一致性，驗(yàn)證了基因芯片技術(shù)篩選出的抗應(yīng)激基因的準(zhǔn)確性。

3 討 論

免疫調(diào)節(jié)因子類 Fcer1 是IgE 受體，表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞，控制重要的促炎免疫調(diào)節(jié)子的產(chǎn)量。Igg3、IgG2a、Ige、IgG1、Igf、IGFBP6、Igfbp、Iga、Igm、Immunoglobulin 和IgG2b 這些免疫球蛋白以及IFN alpha/beta、NFkB（complex）細(xì)胞因子在多種免疫防御機(jī)制中起著重要作用。脾酪酸激酶Syk 是B 細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最重要的激酶，BCR 激活后，依賴Syk 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)整B 細(xì)胞克隆的表達(dá)、分化或凋亡，妊娠中期Syk 缺失的小鼠會(huì)死亡[9]。Syk/JNK 信號(hào)通路在炎癥激活、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)中也起著非常重要的作用[10]。而妊娠本就是炎性反應(yīng)過程，本研究檢測(cè)到的這些免疫調(diào)節(jié)子在維持妊娠的正常進(jìn)行中起著非常關(guān)鍵的作用。

持續(xù)性熱應(yīng)激造成了乳酸脫氫酶（LDL）和堿性磷酸酶（ALP）活性顯著提高，而免疫球蛋白濃度顯著下降[11]。本試驗(yàn)通過1 000 km 的長(zhǎng)途運(yùn)輸，在孕鼠垂體和子宮組織中也檢測(cè)到了相似的表達(dá)現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)錄因子arid3a 是DNA 結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，能夠增加B 淋巴細(xì)胞中免疫球蛋白基因的表達(dá)但卻抑制胎兒成纖維細(xì)胞中其他基因的表達(dá)[12-14]。研究表明，arid3a 對(duì)干擾素α的表達(dá)非常重要[15-16]，而干擾素α 會(huì)引起病原體的炎性反應(yīng)。本研究通過表達(dá)譜芯片的方式篩選出運(yùn)輸應(yīng)激后arid3a 的表達(dá)上調(diào)了2.95，說(shuō)明在應(yīng)激條件下機(jī)體為了適應(yīng)環(huán)境，調(diào)動(dòng)了各種免疫調(diào)控機(jī)制（包括免疫球蛋白）以保證胚胎正常發(fā)育。

顆粒酶是絲氨酸蛋白酶類，通常與穿孔素聯(lián)合發(fā)揮作用以維持細(xì)胞的正常發(fā)育和細(xì)胞周期的穩(wěn)定，及時(shí)清除體內(nèi)受損細(xì)胞，以維持組織器官及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞凋亡的途徑之一即是穿孔素/顆粒酶凋亡信號(hào)通路。在細(xì)胞免疫反應(yīng)中當(dāng)病原感染目標(biāo)細(xì)胞時(shí)釋放顆粒酶。顆粒酶A 除了具有細(xì)胞毒性功能外，還能夠激活細(xì)胞外炎癥因子的產(chǎn)生，從而允許細(xì)胞毒性細(xì)胞接近組織內(nèi)的靶細(xì)胞。早期反復(fù)流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織中顆粒酶B的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照個(gè)體[17]。顆粒酶D 表達(dá)于小鼠肥大細(xì)胞，其表達(dá)量取決于肥大細(xì)胞的成熟程度[18]。顆粒酶F 特異性的表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞中，很可能在固有性免疫中起作用，其底物是Drp1[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸應(yīng)激小鼠子宮中顆粒酶A、顆粒酶B、顆粒酶C、顆粒酶D 和顆粒酶F 的表達(dá)與正常對(duì)照小鼠相比急劇下降，尤其是顆粒酶D 和F，其表達(dá)量分別下降了1 479.26 倍和1 301.06 倍。提示顆粒酶可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著某種重要的作用，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究和探討。

表7 垂體組織中前5 個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所包含的基因

表8 子宮組織中前5 個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所包含的基因

表9 定量PCR 結(jié)果與芯片結(jié)果的比較

綜上所述，經(jīng)過長(zhǎng)途運(yùn)輸后孕中期小鼠垂體和子宮組織中檢測(cè)到一系列差異表達(dá)的基因，包括免疫球蛋白類和顆粒酶類等，它們都在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮著重要作用，其在子宮組織中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。