山羊環(huán)狀RNA circ_ZCCHC24 表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

陶 虎 ，張 元，楊 娟，張 年，熊 琪，劉 洋，陳明新*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2.黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北黃岡 438000）

羊?qū)儆谏偬?dòng)物，母羊的繁殖力是決定養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)效益的最重要因素之一，提高母羊繁殖性能在育種工作中尤為重要[1]。我國山羊產(chǎn)業(yè)規(guī)?；图s化程度相對(duì)較低，關(guān)于山羊繁殖性狀遺傳規(guī)律的研究有限，限制了山羊繁殖性狀的選育提高。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類新型的內(nèi)源性非編碼RNA，它是在mRNA 前體（pre-mRNA）剪切過程中，外顯子和（或）內(nèi)含子以反向剪切形式連接的磷脂鍵，最終以共價(jià)閉合形態(tài)存在的環(huán)狀RNA 分子[2-3]。circRNA具有環(huán)狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)特異性等特性[4-5]。目前，circRNA 的研究多集中于醫(yī)學(xué)方面[6-7]，在家畜中研究較少，尤其在家畜繁殖性狀中的研究還處于初始階段。circRNA 主要通過與RNA 結(jié)合蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，調(diào)控線性親本基因的轉(zhuǎn)錄[8]；吸附miRNA調(diào)控基因的表達(dá)[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)circRNA 能夠編碼蛋白質(zhì)，發(fā)揮生物學(xué)功能[9-10]。circRNA 調(diào)控卵泡發(fā)育的研究較為有限。有報(bào)道顯示，circRNA-3175 通過調(diào)控TESTIN基因抑制奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡[11]。Capel 等[12]在小鼠精子決定基因SRY中發(fā)現(xiàn)了circRNA，并且SRY 也被證實(shí)可以吸附miR-138 從而發(fā)揮“miRNA 海綿”作用[13]。circRNA 具有重要的調(diào)控功能，因此circRNA 已成為新的非編碼RNA 研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來對(duì)于circRNA 的研究日益增多，但對(duì)circ_ZCCHC24在山羊卵泡中的作用機(jī)制還未見詳細(xì)研究。本研究以前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析得到的circ_ZCCHC24為研究對(duì)象，通過構(gòu)建其真核表達(dá)載體，研究circ_ZCCHC24對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，為揭示circ_ZCCHC24對(duì)山羊卵泡發(fā)育的遺傳調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 自在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種羊場(chǎng)和湖北波爾山羊保種場(chǎng)選擇18 月齡的成年母羊，采集山羊血液和卵巢樣品。樣品采用全血基因組DNA 提取試劑盒（百泰克公司）進(jìn)行提取，-20℃保存?zhèn)溆?；聚合酶I-5?2×High-Fidelity Master Mix 購自北京擎科公司。Ecos 感受態(tài)細(xì)胞和pcDNA3.1 表達(dá)載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；質(zhì)粒pMD18-T Vector 購自寶生物工程（大連）有限公司；環(huán)狀RNA 表達(dá)載體pCD2.1-ciR 購自吉賽生物；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ、T4 DNA 連接酶及高保真DNA 聚合酶購自NEB 公司；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)狀RNA circ_ZCCHC24 編碼序列的擴(kuò)增 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析得到circ_ZCCHC24 的全長序列，設(shè)計(jì)合成引物對(duì)pc-circ_ZCCHC24-PF/PR，并在上下游引物5′端分別引入了KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以山羊DNA 為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期片斷長度為2 045 bp。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃變性10 s，72℃變性20 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR 儀為Mini CyclerTM 基因擴(kuò)增儀。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，利用DNA 快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將circ_ZCCHC24 擴(kuò)增膠回收片段和pCD2.1-ciR 載體質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切并切膠回收。二者回收產(chǎn)物加入T4 連接酶和Buffer，16℃連接2 h，連接反應(yīng)體系：2 種膠回收產(chǎn)物各4 μL、1 μL 10×Buffer、1 μL T4 連接酶。連接體系加入50 mL Ecos 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含Amp（氨芐）的LB 固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中過夜。利用含有Amp 的LB 培養(yǎng)基篩選陽性克隆。將陽性菌液送北京奧科生物科技公司測(cè)序驗(yàn)證，提取重組載體質(zhì)粒備用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及circ_ZCCHC24 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存，細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12 中加入10%的胎牛血清，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37℃。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%的融合度，使用胰酶消化后均勻接種于6 孔板中。每孔加入7 μL 的lipofectmin3000 和2.5 μg circ_ZCCHC24表達(dá)載體質(zhì)粒于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后提取RNA，均-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物與探針信息

1.2.4 circ_ZCCHC24 基因表達(dá)分析 將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，設(shè)計(jì)定量引物（表1），利用qRT-PCR 檢測(cè)超表達(dá)circ_ZCCHC24基因的CHO 細(xì)胞中該基因表達(dá)水平。qRTPCR 反應(yīng)總體系20 μL：cDNA 模板各1 μL，SYBR?Green Supermix 10 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.25 μL，去離子水加至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸45 s。儀器采用Mini CyclerTM 基因擴(kuò)增儀，利用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

1.2.5 山羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) 山羊屠宰后取出整個(gè)卵巢組織，置于裝有預(yù)冷PBS 的無菌培養(yǎng)皿中；用加有雙抗的PBS 緩沖液沖洗血污，漂洗3 次；剝凈卵巢中卵泡的外膜、結(jié)締組織等；選取體積適中的卵泡，用無菌一次性針管抽取卵泡液；PBS 洗滌抽取出的卵泡液中的顆粒細(xì)胞，重復(fù)3 次；將洗滌后的顆粒細(xì)胞接種于含15%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基的6 孔板內(nèi)，測(cè)定細(xì)胞密度，調(diào)整懸浮液細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，更換新鮮含有15%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，貼壁后可用于后續(xù)研究。

1.2.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 用5 mL MTT 溶劑溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL 的MTT 溶液；待顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至80%的融合度，使用胰酶消化后均勻接種于96孔板中。每孔加入0.3 μL 的lipofectmin3000 和0.1 μg circ_ZCCHC24 表達(dá)載體質(zhì)粒于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次標(biāo)記為1、2、3、4、5、6 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔；分別在上述6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL MTT 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h；每孔加入100 μL 藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（Formazan）溶解液，適當(dāng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3～4 h；采用酶標(biāo)儀在570 nm 測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊circ_ZCCHC24基因編碼區(qū)擴(kuò)增 提取山羊全血DNA，通過PCR 擴(kuò)增circ_ZCCHC24基因的全長序列。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，片段長度與預(yù)期結(jié)果相符（circ_ZCCHC24 的全長序列為2 045 bp），并未出現(xiàn)非特異性條帶（圖1）。

圖1 山羊circ_ZCCHC24 基因全長序列的擴(kuò)增

2.2 山羊circ_ZCCHC24基因表達(dá)載體的構(gòu)建 山羊circ_ZCCHC24基因的全長序列的PCR 產(chǎn)物回收產(chǎn)物和pcD2.1 表達(dá)載體質(zhì)粒（圖2）經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后，切膠回收。利用T4 連接酶，連接pcD2.1 表達(dá)載體質(zhì)粒和circ_ZCCHC24基因的全長序列的雙酶切回收產(chǎn)物，并克隆轉(zhuǎn)化入Ecos 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑選陽性克隆進(jìn)行如下鑒定。

圖2 環(huán)狀RNA 表達(dá)載體pCD2.1 的模式圖

2.2.1 雙酶切鑒定 將陽性克隆的菌液提取質(zhì)粒，利用KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后分別釋放出兩條相應(yīng)大小的特異性條帶，較大的條帶為表達(dá)載體序列，2 045 bp 處為山羊circ_ZCCHC24基因的全長序列（圖3），結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2.2 測(cè)序鑒定 將陽性菌液進(jìn)行sanger 測(cè)序，所得堿基序列利用序列在線比對(duì)軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，目的片段與NCBI 數(shù)據(jù)庫中提交的片段序列完全一致（圖4）。

圖3 DKK2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)效率 將山羊circ_ZCCHC24表達(dá)載體pc-circ_ZCCHC24 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h 提取RNA，利用qRT-PCR 檢測(cè)重組表達(dá)載體質(zhì)粒的表達(dá)效率。由圖5 可見，過表達(dá)pccirc_ZCCHC24基因后，細(xì)胞中circ_ZCCHC24基因的mRNA 表達(dá)量升高了41.3 倍（P＜0.01），說明pCD2.1表達(dá)載體能夠使circ_ZCCHC24基因的線性序列正確成環(huán)，載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT 法檢測(cè)重組質(zhì)粒調(diào)控山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖經(jīng)MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pc-circ_ZCCHC24 表達(dá)載體質(zhì)粒的山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖速率相對(duì)于pCD2.1 空載體對(duì)照組明顯加快，試驗(yàn)組第2 天和第3 天增殖速率與對(duì)照組相比達(dá)到極顯著水平，第4 天增殖速率達(dá)到顯著水平（圖6）。表明過量表達(dá)山羊環(huán)狀RNAcirc_ZCCHC24可以加速山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。

3 討 論

哺乳動(dòng)物卵泡的產(chǎn)生是一種由原始卵泡發(fā)育成排卵前卵泡的連續(xù)復(fù)雜過程[14]。其中，卵泡顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可為卵母細(xì)胞提供必需的生長因子和特定蛋白質(zhì)，卵泡顆粒細(xì)胞的增殖可誘導(dǎo)卵泡的生長和卵母細(xì)胞的成熟[15]。卵泡發(fā)生的復(fù)雜性表現(xiàn)在卵母細(xì)胞的發(fā)育需要眾多基因組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮作用[16]。然而，動(dòng)物卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞增殖的決定性調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

長久以來，非編碼RNA 被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄垃圾，不發(fā)揮任何作用。然而越來越多的研究表明，包括miRNAs、circRNAs、piRNA 和lncRNA 等在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[2,17-18]。

圖4 DKK2 基因表達(dá)載體序列測(cè)序比對(duì)結(jié)果

圖5 circ_ZCCHC24 基因pCD2.1 表達(dá)載體的表達(dá)效率

圖6 circ_ZCCHC24 基因pCD2.1 表達(dá)載體促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖

本研究主要通過克隆得到山羊新環(huán)狀RNAcirc_ZCCHC24基因的全長序列，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了circ_ZCCHC24基因的pcD2.1 表達(dá)載體。pcD2.1 環(huán)狀RNA 表達(dá)載體是一類特殊的載體，在設(shè)計(jì)引物時(shí)已包含了正反向環(huán)化介導(dǎo)序列，可以使circ_ZCCHC24序列過表達(dá)后可以正確的環(huán)化為環(huán)狀RNA。所得到的重組環(huán)狀RNA 表達(dá)載體利用雙酶切和測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證了正確性。

circRNA 在山羊發(fā)育過程中的功能的研究較少，現(xiàn)有的文獻(xiàn)大多集中在利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)羊中環(huán)狀RNA 進(jìn)行篩選鑒定。作者前期研究中利用測(cè)序技術(shù)鑒定了不同繁殖力山羊排卵前卵泡中差異表達(dá)的circRNA，并對(duì)circRNA 的功能進(jìn)行了初步研究[19]。Cao 等[20]鑒定了綿羊骨骼肌中circRNA 的表達(dá)模式。在羔羊脾臟中，circRNA 表達(dá)模式與大腸桿菌F17 的拮抗作用相關(guān)[21]。circRNA 對(duì)山羊繁殖性能的研究鮮見報(bào)道。僅有少量研究表明，卵泡中顆粒細(xì)胞分泌的性腺激素對(duì)卵泡具有支持作用，對(duì)卵巢發(fā)揮正常功能至關(guān)重要[22-23]。因此，本研究利用circRNA 特定的表達(dá)載體，對(duì)circ_ZCCHC24表達(dá)載體質(zhì)粒在山羊卵泡顆粒細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ_ZCCHC24可以上調(diào)顆粒細(xì)胞增殖速率。本研究為深入研究circ_ZCCHC24對(duì)山羊卵泡發(fā)育的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了山羊新環(huán)狀RNAcirc_ZCCHC24基因的過表達(dá)載體，利用雙酶切凝膠電泳和測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證了表達(dá)載體序列的正確性，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ_ZCCHC24能夠促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖，為深入研究circ_ZCCHC24對(duì)山羊卵泡發(fā)育的功能奠定基礎(chǔ)。