叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1在冬蟲夏草預(yù)防糖尿病模型大鼠對(duì)比劑腎病中的機(jī)制

戈立秀 趙凱 高巧營(yíng) 宗春輝 常艷敏

(天津市南開(kāi)醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，天津 300100;2心內(nèi)一科;3天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所)

對(duì)比劑腎病(CIN)是指使用對(duì)比劑24～72 h后發(fā)生的無(wú)其他原因可解釋的急性腎損傷，是應(yīng)用對(duì)比劑后最常見(jiàn)的并發(fā)癥。當(dāng)患者伴有糖尿病、慢性腎臟病或高血壓等基礎(chǔ)疾病時(shí)，使用高滲對(duì)比劑可使CIN發(fā)生率高達(dá)25%〔1，2〕。有研究顯示對(duì)比劑可直接損傷腎小管，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡，加劇腎損傷〔3〕。蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/P70核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)信號(hào)通路是一條經(jīng)典的抗凋亡通路，既往研究發(fā)現(xiàn)對(duì)比劑可下調(diào)磷酸化Akt/mTOR水平〔4，5〕，而PI3K/Akt通路又可調(diào)節(jié)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(Fox)O1磷酸化水平。FoxO1是FoxO亞家族中的一員，在抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)糖脂代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯及調(diào)控細(xì)胞周期等方面發(fā)揮重要的作用〔6〕。提示Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路可影響FoxO1水平，促進(jìn)腎細(xì)胞凋亡，這為糖尿病患者CIN的機(jī)制研究提供了新方向。

冬蟲夏草是一種名貴蟲草屬植物類藥用真菌，具有改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、減少促炎因子釋放、調(diào)節(jié)微循環(huán)、減輕腎損傷等功效，并通過(guò)保護(hù)和調(diào)節(jié)腎組織表皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腎小管修復(fù)和再生，保護(hù)腎臟〔7〕。目前關(guān)于冬蟲夏草預(yù)防CIN的分子學(xué)機(jī)制研究較少，本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)〔3，8，9〕，糖尿病患者給予普羅布考干預(yù)后行介入診療時(shí)CIN的發(fā)生率明顯降低，并且腎功能及腎損傷等指標(biāo)都有明顯改善。因此，本文以普羅布考為陽(yáng)性對(duì)照藥，探討FoxO1在冬蟲夏草預(yù)防糖尿病模型大鼠CIN中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠80只，體重240～260 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境所動(dòng)物中心。

1.2試劑、儀器 鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；冬蟲夏草原粉(杭州中美華東制藥有限公司惠贈(zèng))；碘克沙醇注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；血清尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)試劑盒(南京建成科技有限公司)；尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)和白細(xì)胞介素(IL)-18(上海藍(lán)基生物有限公司)；腎損傷因子(KIM)-1檢測(cè)(美國(guó)R&D公司)；兔抗小鼠FoxO1單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化(p)-FoxO1(ser256)多克隆抗體，美國(guó) Epitomics 公司；p-Akt(Ser473)抗體、p-mTOR(Ser2448)抗體、p-P70S6K、β-actin(Cell Signaling公司)；動(dòng)物組織RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(北京天根生化科技有限公司)。蛋白核酸測(cè)定儀(Eppendorf AG公司)；Western印跡電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Q5型熒光定量PCR儀、垂直電泳及轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-rad公司)；病理包埋機(jī)、切片機(jī)(LEICA公司)；LEICA DM4000B正置顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)。

1.3糖尿病大鼠模型建立及分組 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，造模前檢測(cè)尾靜脈血糖，均在正常范圍。隨機(jī)選取20只大鼠為正常對(duì)照組(N組)，其余60只大鼠腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及7 d后斷鼠尾測(cè)血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型成功，將成功建模的糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為對(duì)比劑腎病組(M組)、冬蟲夏草組(D組)、普羅布考組(P組)，每組20只。

1.4CIN模型建立 根據(jù)CIN造模及用藥方法〔10〕，SD大鼠飼養(yǎng)10 w后，D組給予冬蟲夏草3.0 g/kg灌胃，P組給予普羅布考500 mg/kg灌胃，N組、M組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)6 d，第7天禁水不禁食。7 d后，麻醉狀態(tài)下，除N組外其他三組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射對(duì)比劑碘克沙醇320(2.0 g/kg)，注射時(shí)間為5 min，然后給予自然飲水。以注射對(duì)比劑24 h后Scr比N組升高(>25%)判定CIN的模型是否成功。

1.5實(shí)驗(yàn)取材 注射對(duì)比劑后24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，開(kāi)腹取下腔靜脈血2 ml，迅速取下雙腎。左腎剖開(kāi)部分固定于甲醛，以備腎臟病理研究；右腎-80℃凍存，用于檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.6腎功能及損傷指標(biāo)檢測(cè) 脲酶法測(cè)定血清BUN；苦味酸法測(cè)定血清Scr；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)NGAL、腎KIM-1、IL-18。

1.7腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 硝酸還原酶法檢測(cè)一氧化氮(NO)，氧化還原法測(cè)定一氧化氮合酶(NOS)，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)，比色法測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)。

1.8Akt/mTOR/P70S6K與FoxO1的mRNA含量檢測(cè) Trizol法提取腎臟組織總RNA，引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)IQ5型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)。參照 2-ΔΔCt法〔11〕進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 各基因引物序列

1.9Western印跡 提取腎組織總蛋白，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)、放射自顯影，檢測(cè)腎組織p-Akt/p-mTOR/p-P70S6K及FoxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)量。

1.10病理學(xué)形態(tài)檢測(cè) 腎組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片后進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、HE染色，于正置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組造影24 h后腎功能、腎損傷指標(biāo)變化情況 與N組比較，M組BUN、Scr、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯升高(P<0.05)；D組BUN、Scr明顯升高，NGAL、KIM-1、IL-18明顯降低；P組BUN、Scr、NGAL明顯升高，IL-18明顯降低(均P<0.05)，KIM-1無(wú)明顯變化。與M組比較，P組BUN、Scr、NAGL、IL-18含量明顯降低(P<0.05)，而KIM-1無(wú)明顯變化(P>0.05)；D組BUN、Scr、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯降低(P<0.05)。與P組比較，D組Scr、BUN、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 與N組比較，M組NO、NOS、MDA含量明顯升高，SOD、T-AOC含量明顯下降(P<0.05)。與M組比較，D組MDA含量明顯降低，NO、NOS、SOD和T-AOC含量明顯升高；P組MDA含量明顯降低，NO、NOS和SOD含量明顯升高(P<0.05)，T-AOC無(wú)明顯變化(P>0.05)。與P組比較，D組T-AOC含量明顯升高(P<0.05)，其余無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 給予藥物干預(yù)后大鼠腎臟功能各指標(biāo)的變化情況

與N組比較:1)P<0.05；與M組比較:2)P<0.05；與P組比較:3)P<0.05；下表同

表3 給予藥物干預(yù)后大鼠腎臟NO、NOS、MDA、SOD、T-AOC的變化

2.3各組腎臟FoxO1表達(dá) 與N組相比，M組FoxO1 mRNA 和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，D組、P組FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。與N組相比，M組p-FoxO1 蛋白表達(dá)升高；與M組相比，D組和P組p-FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低，p-FoxO1/FoxO1 比值顯著降低。見(jiàn)圖1。

2.4Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路mRNA和蛋白表達(dá)變化 與N組相比，M組p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；D組和P組p-Akt、p-mTOR mRNA水平雖明顯下降(P<0.05)，但蛋白表達(dá)水平卻明顯升高(P<0.05)，D組、P組p-P70S6K mRNA與N組相比分別表現(xiàn)為無(wú)明顯差異和明顯下降，蛋白表達(dá)水平均表現(xiàn)為明顯升高。與M組相比，D組和P組p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。見(jiàn)圖2，表4。

圖1 Western印跡檢測(cè)FoxO1和p-FoxO1蛋白表達(dá)

2.5HE染色檢測(cè)腎小球、腎小管損傷程度 N組腎小球、腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯損傷；M組腎小球基底膜增厚，近曲小管腫脹，胞質(zhì)嗜酸性、細(xì)顆粒狀，結(jié)構(gòu)不清，遠(yuǎn)曲小管萎縮，胞質(zhì)透明變性。P組和D組的腎小球基底膜無(wú)明顯增厚，近曲小管輕度嗜酸性變，結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖3。

圖2 Western印跡檢測(cè)磷酸化Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路蛋白表達(dá)

表4 給予藥物干預(yù)后大鼠腎臟Akt/mTOR/P70S6K及FoxO1 mRNA的變化

圖3 各組腎組織病理改變(HE，×200)

3 討 論

目前認(rèn)為CIN是院內(nèi)獲得的急性腎損傷的重要原因之一，其中糖尿病被認(rèn)為是CIN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔12〕。CIN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究報(bào)道冬蟲夏草及普羅布考均可對(duì)藥物所致急性腎損傷動(dòng)物模型具有保護(hù)作用，可促進(jìn)腎小管修復(fù)，改善腎功能〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，與糖尿病CIN大鼠模型相比，給予冬蟲夏草后腎功能指標(biāo)BUN、Scr及腎損傷指標(biāo)NGAL、KIM-1、IL-18均明顯降低;給予普羅布考后，上述指標(biāo)除KIM-1外，其他都有所下降。以上結(jié)果表明冬蟲夏草能夠改善糖尿病CIN大鼠的腎功能，減輕腎損傷。氧化應(yīng)激在 CIN 發(fā)病中起重要作用，這與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)〔15〕。對(duì)比劑可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腎臟活性氧合成增多，首先對(duì)比劑可損傷腎小管細(xì)胞基底膜及系膜細(xì)胞，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化作用，使活性氧產(chǎn)生增加；其次對(duì)比劑可增強(qiáng)腎臟黃嘌呤氧化酶的活性，降低SOD活性，增加腎活性氧合成。研究顯示〔16〕，大鼠腎臟被部分切除后，腎皮質(zhì)及線粒體中MDA含量明顯增加，給予冬蟲夏草治療后，MDA表達(dá)下降，SOD表達(dá)增加，大鼠腎組織抗氧化能力增強(qiáng)。根據(jù)以上研究，本文檢測(cè)了一系列氧化應(yīng)激指標(biāo)。NO化學(xué)性質(zhì)活潑、易擴(kuò)散，適量應(yīng)用可改善微循環(huán)，減輕腎缺血。NO主要由限速酶NOS催化而成。SOD作為防御內(nèi)外環(huán)境中超氧離子損傷的重要酶，可特異性清除氧自由基，是反映腎臟及機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)產(chǎn)生的一種最終代謝產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示，冬蟲夏草可使腎組織中NO含量增加，改善了腎臟微循環(huán)，同時(shí)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)自由基清除及抗氧化應(yīng)激，減輕腎缺血缺氧及腎小管凋亡，達(dá)到改善腎功能的效果。

FoxO1是Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞家族，是一類重要的氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程〔17〕，廖鑫等〔18〕發(fā)現(xiàn)FoxO1的表達(dá)與血糖血脂密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，具有明顯抗氧化應(yīng)激作用的冬蟲夏草組可使FoxO1 mRNA 水平和蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明FoxO1可通過(guò)減少氧化應(yīng)激物質(zhì)的過(guò)度釋放而改善腎臟抗氧化應(yīng)激的能力。也有研究發(fā)現(xiàn)FoxO1 可做為Akt信號(hào)通路的重要中樞位點(diǎn)〔19〕。Akt/mTOR信號(hào)通路是一條經(jīng)典的抗凋亡通路，Akt 磷酸化可激活mTOR，活化的mTOR在激活內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔20〕，并能抑制細(xì)胞凋亡〔4，21〕。P70S6K是mTOR的主要下游作用靶物〔22〕，其本身并不具有生物活性，經(jīng)磷酸化激活后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并和其他蛋白質(zhì)相互作用而形成多蛋白復(fù)合物。本研究結(jié)果顯示，造影劑阻止了Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路的表達(dá)，給予冬蟲夏草和普羅布考后p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA水平雖然有不同程度的降低或無(wú)改變，但相應(yīng)的蛋白水平卻都表現(xiàn)為升高；冬蟲夏草和普羅布考可上調(diào)Akt/mTOR/P70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平，當(dāng)藥物給予信號(hào)通路上游一定刺激后，Akt/mTOR/P70S6K被磷酸化激活，活化的信號(hào)進(jìn)入核內(nèi)激活其下游的FoxO1，F(xiàn)oxO1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高，而p-FoxO1表達(dá)顯著降低，p-FoxO1易失去轉(zhuǎn)錄活性。故認(rèn)為冬蟲夏草可通過(guò)上調(diào)Akt/mTOR/P70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)FoxO1表達(dá)升高。

本研究探討FoxO1在冬蟲夏草預(yù)防糖尿病CIN大鼠模型中的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)上游信號(hào)Akt/mTOR/P70S6K通路及靶轉(zhuǎn)錄因子 FoxO1重新整合凋亡信息，其機(jī)制可能是減輕了氧化應(yīng)激和腎細(xì)胞凋亡。本文進(jìn)一步探討了冬蟲夏草對(duì)糖尿病 CIN 的腎臟保護(hù)作用及其對(duì)凋亡信號(hào)通路的影響，為中醫(yī)藥防治 CIN提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。