表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)斑塊狀銀屑病患者Th1/Th2免疫平衡的影響

付丹丹 胡華 張孟杰 李敏 李占國(guó) 田中偉

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，河南衛(wèi)輝 453100

銀屑病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是在多種基因遺傳因素的共同作用下，由輔助性T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)［1］。輔助性T 細(xì)胞可分為T(mén)h1 和Th2 兩個(gè)亞群，其介導(dǎo)的免疫功能失衡在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。尋常型斑塊狀銀屑病沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從綠茶中提取出的多酚活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗癌等多種作用［3-4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞功能抑制結(jié)腸炎的炎性水平，提示其可能通過(guò)影響Th1/Th2 的免疫平衡對(duì)炎性疾病起治療作用［5］。本研究以 Th1 和 Th2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討EGCG對(duì)銀屑病Th1/Th2免疫細(xì)胞平衡的影響及機(jī)制，為EGCG在銀屑病治療中的可能應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.研究對(duì)象：尋常型斑塊狀銀屑病患者33例，其中男 18 例，女15 例，年齡22～56 歲。銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）2.4 ～ 12.3，病程3個(gè)月至5年。均來(lái)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，受試者均根據(jù)《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》［6］的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，且1 個(gè)月內(nèi)未經(jīng)治療。所有患者均無(wú)其他系統(tǒng)性疾病和自身免疫性疾病。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018119），受試者均簽署知情同意書(shū)。

2.主要試劑：胎牛血清、青霉素、鏈霉素和RPMI 1640 培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品。EGCG產(chǎn)自江蘇凱吉生物公司（CAS：989-51-5，純度≥98%）。人白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-10 和干擾素 γ（interferonγ，IFNγ）ELISA 試劑盒為美國(guó)R&D Systems 公司產(chǎn)品。Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒產(chǎn)自大連TaKaRa公司。Th1 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA3和β肌動(dòng)蛋白引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本采集：抽取銀屑病患者空腹肘靜脈血10 ml放置于肝素鈉抗凝管中。密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。細(xì)胞加入含10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.MTT檢測(cè)細(xì)胞活力：PBMC以6× 103個(gè)/孔接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。EGCG 溶解于不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，PBMC 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分別加入20、40、60、80、100 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG 的正常培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)24 h。棄原培養(yǎng)液后每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）檢測(cè)細(xì)胞吸光度（A490 值），計(jì)算細(xì)胞活力，選取EGCG 作用濃度。

3.EGCG 處理PBMC：隨機(jī)選取3 例斑塊狀銀屑病患者的PBMC，加入60 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG的正常培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)24 h后作后續(xù)檢測(cè)。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1 和Th2 細(xì)胞比例：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，PBS 洗滌、離心，再用100 μl 緩沖液重懸細(xì)胞后，加入 FITC-CD4 進(jìn)行表面染色、固定和破膜，隨后加入PE-IFNγ或PE-IL4，4 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞比例。

5.ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞因子：PBMC 經(jīng)過(guò)EGCG處理后，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Th1 細(xì)胞分泌因子（IL-2 和IFNγ）和Th2細(xì)胞分泌因子（IL-4和IL-10）表達(dá)量。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，100 ng總RNA用逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，用qRT-PCR 試劑盒檢測(cè)T-bet、GATA3 mRNA表達(dá)水平。T-bet正向引物序列為5′-CCCATCCCTTCCCTGTAT-3′，反向引物為 5′-GTC CATTCTCCGTTCTCCA-3′；GATA3的正向引物為 5′-TCACAAAATGAACGGACAGAACC-3′，反向引物為 5′-GGTGGTCTGACAGTTCGCAC-3′；β 肌動(dòng)蛋白正向引物序列為 5′ -CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，反向引物為5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，40 ℃ 15 min。2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTT法檢測(cè)EGCG對(duì)PBMC的毒性

見(jiàn)圖1。EGCG 作用 PBMC 24 h 后，與對(duì)照組（不加EGCG）相比，20、40、60 μmol/L EGCG組PBMC活力沒(méi)有顯著變化，80 μmol/L 組和100 μmol/L 組顯著下降（t=5.17，P=0.006；t=10.09，P=0.005）。因此選擇60 μmol/L為EGCG作用細(xì)胞的最適無(wú)毒濃度。

二、EGCG對(duì)Th1/Th2比例的影響

見(jiàn)圖2。60 μmol/L EGCG 處理 PBMC 后，Th1的細(xì)胞水平低于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.43，P=0.026）；Th2細(xì)胞水平高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.68，P=0.026）。

三、EGCG 對(duì)銀屑病患者Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EGCG 組IL-2 和IFNγ水平顯著降低（P＜ 0.05），IL-4和IL-10表達(dá)水平顯著提高（P＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

四、EGCG對(duì)銀屑病患者 Th1、Th2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

60 μmol/L EGCG 處理細(xì)胞后，EGCG 組 T-bet mRNA表達(dá)量（1.21±0.19）低于對(duì)照組（2.56±0.22），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 11.99，P＜ 0.001）；GATA3 mRNA表達(dá)量（3.21 ± 0.24）高于對(duì)照組（1.47± 0.11），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.62，P＜ 0.001）。

討 論

圖1 不同濃度沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞活力的影響 1 ～ 6：分別為0（對(duì)照組）、20、40、60、80、100 μmol/L EGCG組

圖2 沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1 和Th2 細(xì)胞的影響 2A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1 和Th2細(xì)胞數(shù)；2B：不同組中Th1和Th2細(xì)胞占PBMC的比例

表1 沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）刺激下外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞分析細(xì)胞因子變化（，ng/L）

表1 沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）刺激下外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞分析細(xì)胞因子變化（，ng/L）

注：a 與對(duì)照組比較，P＜0.05

分組對(duì)照組EGCG t值P值白細(xì)胞介素2 1 568.32±196.45 824.45±101.21a 5.83 0.004干擾素γ 3 287.63±235.54 1 623.62±185.56a 9.61＜0.001白細(xì)胞介素4 225.38±26.92 389.48±46.63a 5.28 0.006白細(xì)胞介素10 165.46±32.25 285.95±53.28a 3.35 0.029

研究證明，EGCG 具有抗炎活性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、食管炎等疾病有治療作用［7］。Th1/Th2免疫比例失衡在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中也起到重要作用［8］。通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2比例減緩疾病嚴(yán)重程度已成為研究熱點(diǎn)之一［9］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可以抑制IL-17 誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡異常［10］。為了研究EGCG 對(duì)斑塊狀銀屑病免疫的影響，在本研究中，我們利用斑塊狀銀屑病患者PBMC，研究EGCG 對(duì)Th1/Th2 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

T 細(xì)胞的效應(yīng)功能大部分是通過(guò)細(xì)胞因子調(diào)控的，不同的T細(xì)胞亞群通過(guò)分泌特異細(xì)胞因子發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。Th1 型細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子IFNγ和IL-2活化毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷和吞噬［11］。研究表明，IFNγ 和IL-2 在銀屑病患者的血清和皮損中表達(dá)顯著升高［12］。銀屑病患者Th2細(xì)胞通過(guò)分泌IL-4和IL-10因子發(fā)揮炎癥抑制作用，并且IL-4 和IL-10 在輕重度銀屑病患者血清中均出現(xiàn)異常低表達(dá)［13-14］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病患者外周血中IFNγ和 IL-2 高表達(dá)，而 IL-4 和 IL-10 低表達(dá)［15］。本文結(jié)果表明，EGCG 降低銀屑病患者PBMC Th1 細(xì)胞因子IL-2和IFNγ分泌量，同時(shí)增加Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10分泌量，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

為了探討EGCG 對(duì)斑塊狀銀屑病可能的治療作用，我們針對(duì)性探討了EGCG對(duì)斑塊狀銀屑病患者 PBMC 的影響。結(jié)果顯示，EGCG 能下調(diào) Th1 細(xì)胞水平，上調(diào)Th2細(xì)胞水平，表明其對(duì)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡有調(diào)節(jié)作用。在T 細(xì)胞的亞群分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子具有重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和 GATA3 分別特異性表達(dá)在 Th1 和 Th2 細(xì)胞中。研究表明，T-bet 不僅能夠促進(jìn)Th1 細(xì)胞因子IFNγ、IL-12 的產(chǎn)生，而且可以抑制Th2 細(xì)胞因子IL-4的產(chǎn)生，即其具有促進(jìn)Th1型細(xì)胞分化作用的同時(shí)也能抑制Th2 型細(xì)胞分化［16］。轉(zhuǎn)錄因子GATA3 能夠通過(guò)提升 IL-4 并抑制 IFNγ 的表達(dá)，促進(jìn)發(fā)育中的Th1 型細(xì)胞反轉(zhuǎn)為T(mén)h2 型，特異性的調(diào)控 Th2 細(xì)胞的分化［17］。本研究結(jié)果顯示，EGCG 抑制銀屑病患者PBMC 中T-bet mRNA 表達(dá)，并促進(jìn)GATA3 mRNA 表達(dá)，說(shuō)明 EGCG 對(duì) Th1 和 Th2 型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，EGCG 能夠減少銀屑病患者Th1細(xì)胞數(shù)量，抑制Th1細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Th2 細(xì)胞數(shù)量及Th2細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提示EGCG可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞平衡，影響銀屑病的發(fā)病進(jìn)程。在今后的研究中，我們可以繼續(xù)探索EGCG對(duì)銀屑病患者免疫異常的影響，例如對(duì)Th17，Treg 等免疫細(xì)胞影響等。另外還會(huì)從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)出發(fā)，研究在動(dòng)物模型中EGCG的藥物作用，為其在臨床上的應(yīng)用提供更多依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突