燃燒吧！獨腳大仙

張巖峰

也許難以想象，但我們確實在做一件偉大的事兒，那可是制造傳說中的家伙啊。

如果不是那個沉迷中國傳說異獸，想法超多的企業(yè)家路易斯·劉，拿著《山海經(jīng)》找到我們實驗室，恐怕這個世界的人不會有機(jī)會親眼見一見那只傳說里的大鳥了。

這位頭頂發(fā)量不太感人的矮個子商人雖然腦子里時常蹦出些稀奇古怪的點子，但他從商五十余載，很少做賠本買賣，這次，他更是派人認(rèn)真做了調(diào)研，對書中的異獸進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選——

長著人臉的，不太現(xiàn)實。

能上天的水生物，再考慮考慮？

太簡單、沒技術(shù)含量的，沒啥挑戰(zhàn)性可不行。

最終，我們從書中400多只神怪中選出了最合心意的一只——畢方。

畢方簡史

有鳥焉，其狀如鶴，一足，赤文青質(zhì)而白喙，名日畢方，其鳴自叫也，見則其邑有訛火。

——《山海經(jīng)·西山經(jīng)》

畢方，中國神話中火神的侍寵，又稱火鴉。除了在《山海經(jīng)》中的描述外，東漢著名天文學(xué)家張衡在名篇《東京賦》中也提到了這只神鳥。

因為跟火扯上了關(guān)系，在我國古代的神話傳說中，畢方被認(rèn)為是大火之兆。成書于萬歷十五年的辭典《駢雅》在解釋畢方時只用了四個字——“兆火鳥也”。也有人考證畢方的名字可能來自竹子和木頭（我國古代最主要的兩種燃料）燃燒時發(fā)出的噼啪聲音，集雜家大成的西漢著作《淮南子》中就有“木生畢方”的說法。

象征火的怪獸，似乎與生俱來地?fù)碛序?qū)逐鬼怪的能力?！俄n非子》中記載畢方作為火的象征和黃帝蛟龍戰(zhàn)車的旁侍，曾在泰山救駕，幫助黃帝躲避政敵的刺殺。

但在許多記載中，并沒有說獨腳怪畢方只有一條腿，所以很多人認(rèn)為畢方其實就是火烈鳥。

比如火烈鳥的鳥喙有三種顏色，由上而下為白紅黑，很容易被認(rèn)作是白色的鳥喙叼著著火的炭火。而所渭的一條腿，我們也很容易聯(lián)想到火烈鳥單腿休息的樣子。

如果能以火烈鳥為原型進(jìn)行試驗，那么我們要做的就是利用基因編輯技術(shù)，讓火烈鳥只長出一條腿。聽著好像挺簡單，但目前所知的地球生物中，還沒有發(fā)現(xiàn)單數(shù)足的動物，所以這其實是個技術(shù)活兒。

并且，選擇畢方還有個最大的好處，火烈鳥本身的棲息地之一也在西印度群島，也就是我們實驗室所在地，小島的環(huán)境非常適合火烈鳥的生存，這無疑給畢方的建造，創(chuàng)造了非常優(yōu)良的外部環(huán)境。

至此，Befun項目正式啟動，取這個名字的時候，我的意圖很明顯，希望在整個實驗過程中，所有人都能獲得快樂。

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火烈鳥又名紅鸛、紅鶴，為一種大型水鳥，主要分布于非洲、中南美洲，以及印度等部分亞熱帶地區(qū)。它的脖子很長，常彎曲成S形，體高1～1.4米，翼展可達(dá)1～1.6米?；C據(jù)表明火烈鳥祖先早在3000萬年以前的中新世就開始分化，遠(yuǎn)早于大多數(shù)別的鳥類。

獨腳獸，站起來

先弄掉一只腿試試？

足作為行走工具，從功能上講需要對稱，所以幾乎所有動物的足都是偶數(shù)。然而，我們也發(fā)現(xiàn)，許多小型鳥，比如麻雀，在平地上卻沒有行走能力，只能依靠雙腿一起快速頻繁跳躍。

然而像畢方這樣的大型鳥，單足跳幾乎是無法想象的。只剩一只腳的鳥，雖然能夠存活，但由于它原本細(xì)長的腿，無法適應(yīng)跳躍和飛行落地時產(chǎn)生的沖量，很快便會出現(xiàn)腿骨骨折的現(xiàn)象，所以我們要在實驗中注意加強(qiáng)腿的力量。而為了畢方在跳躍時保持平衡，它的腿還必須位于腹部正中。

最省事的辦法是將鴕鳥的腿移植到火烈鳥身上，再加強(qiáng)單足的強(qiáng)壯度。但顯然這并不是一個好辦法。用過于簡單粗暴的肢體拼湊得到的生物，和小說《科學(xué)怪人》中弗蘭肯斯坦搞出的怪物沒啥兩樣，并且移植的性狀無法遺傳，所以我們并不打算采用。

于是我們從基因編輯入手，先對火烈鳥的基因序列進(jìn)行了檢測，畢竟在鳥類演化的歷程中，也并不存在單腳蹦跶的異類。托前輩們的福，21世紀(jì)初，國際鳥類基因組聯(lián)盟就已經(jīng)完成了對火烈鳥的基因組測序，并且進(jìn)行了初步的比較基因組學(xué)研究，解釋了一些鳥類進(jìn)化的問題。50年后，對火烈鳥的全基因組關(guān)聯(lián)分析也基本完成。有了這些研究基礎(chǔ)，制造畢方完全有可能。

基因敲除初嘗試

任何科研項目，在還是ldea的階段都是靠譜的，然而真正開始實驗了，就會出現(xiàn)非常多的問題。不過作為訓(xùn)練有素的實驗生物學(xué)家，我們早就習(xí)慣了在解決問題的時候發(fā)現(xiàn)新的問題。

一開始我們嘗試了最簡單的基因敲除，有選擇地敲除一條染色體上控制腿部發(fā)育的基因?；蚯贸?jīng)過兩百多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一項選擇面極廣的成熟生物技術(shù)。以CRISPR為模版基因的編輯技術(shù)，可以配合的蛋白非常多，單單Cas蛋白的改進(jìn)版本就有不下200個，大腸桿菌TadA的進(jìn)化也超過一百代。雖然咱不差錢吧，但顯然要全部正交篩選一遍是不現(xiàn)實的。我們花了兩周時間設(shè)計出上百個實驗手段，從概率上來說至少能覆蓋所有實驗結(jié)果可能性的99.99999%。

另外，我們希望未來的畢方能形成種群，所以必須雌雄搭配。所以，我們分別對八對雌雄火烈鳥，其十六只進(jìn)行了胚胎干細(xì)胞的基因敲除。盡管進(jìn)行了優(yōu)化，工作量還是無比巨大。我們花了3個月的時間種下了1600個希望的種子，然而令人沮喪的是最后啥也沒得到。

絕大多數(shù)的胚胎在導(dǎo)入剪輯過的基因之后都沒有發(fā)育，還有很多在發(fā)育過程中直接流產(chǎn)，唯一誕生的小畢方來自CRISPR/Cas-ZW-0917組。很遺憾，它雖然體征正常，但沒有腿。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，我們認(rèn)為這極有可能受到了基因?qū)ΨQ性控制的影響。就好比在人類和動物的某些遺傳病中，出現(xiàn)一只手或一只腳的情況寥寥無幾，但會出現(xiàn)一只正常發(fā)育，一只畸形的情況。

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根據(jù)達(dá)爾文的《物種起源》，小型鳥的兩肢較短，由股部、脛部、跗部和趾部等部分組成，整個后肢肌肉都分布在股部和脛部，其他部位全是肌腱。這些肌腱貫穿至趾端，能控制足趾的彎曲，使其能握緊樹枝。但由于后肢的脛部跗骨和跗部趾骨之間沒有關(guān)節(jié)臼，脛骨和跗骨之間的關(guān)節(jié)不能打彎，這樣就只能快速頻繁地跳躍。

比較基因組學(xué)

Comparative Genomlcs，基于基因組圖譜和測序技術(shù)，對已知的基因特征和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)制和不同物種親緣關(guān)系的生物學(xué)研究。

全基因組關(guān)聯(lián)分析

Genome-wide association study，指在人類全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），從中篩選出與疾病相關(guān)的SNPs。

終止子

Termlnator，是一段位于基因或操縱組末端的DNA片段，可中斷轉(zhuǎn)錄作用。

內(nèi)源性病毒

Endogenous viral element，簡稱EVE，指非病毒生物體的生殖系基因組中一些來自病毒的DNA序列。其形成之前可能是感染生物體的病毒的整個基因組（原病毒），或病毒基因組的一些片段。當(dāng)病毒的DNA序列融入生殖細(xì)胞的基因組后，可以隨著生殖遺傳到宿主的下一代，直到內(nèi)源化為宿主基因的一部分，稱為內(nèi)源性病毒元件。

孤雄生殖

指在授粉過程中精核進(jìn)入胚囊后，未發(fā)生核融合，卯核解體消失，由精核直接發(fā)育成種子胚，也稱雄核發(fā)育。也就是用同性生殖細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生后代。自然情況下，一些昆蟲、魚類、爬行類和鳥類可以通過孤雌生殖繁衍后代。

新思路！內(nèi)源性病毒拼合

從生命的演化角度來看，我們好像在做一件逆天的事兒，但大段地敲除一條染色體上的基因，顯然造成了成對染色體的長短不一，導(dǎo)致了過高的致畸率。當(dāng)然，生物本身對染色體有一定的容錯率，比如人類男性的一對性染色體就是XY，也并不對稱。我們最初的實驗設(shè)計，實際上就是在挑戰(zhàn)火烈鳥基因中一對常染色體的容錯率。但很不幸，我們賭輸了。

定位到問題所在后，我們采取了第二套方案：在控制腿部發(fā)育的那段基因前后分別改造出三個終止子。我們企圖通過這種方法讓這段基因在胚胎發(fā)育中不被表達(dá)。不過遺憾的是，我們最終得到了一堆一腿正常一腿畸形的鳥寶寶。我們把siRNA和RNAi技術(shù)也應(yīng)用進(jìn)來，卻反而提高了胚胎的畸形率，絕大部分胚胎沒有發(fā)育，我們似乎又回到了原點。

雖然現(xiàn)在說起來云淡風(fēng)輕，但在當(dāng)時我們壓力還是很大的。辛苦一年，什么都沒得到。那段時間項目組的氣壓很低，大家都很萎靡。好在能繼續(xù)嘗試的想法還是很多的。這時，有病毒研究背景的研究員李劍提出了一個驚世駭俗的想法——利用內(nèi)源性病毒。人類基因中有8%從未表達(dá)的基因，它們來自遠(yuǎn)古的內(nèi)源性病毒。當(dāng)年，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA在轉(zhuǎn)化為DNA后并沒有把我們的祖先搞死，反而被人類基因封印，跟隨著人類不斷繁衍。我們嘗試把人類基因中已知的17個內(nèi)源性病毒片段分離并拼合出來，直接替代火烈鳥中控制腿部發(fā)育的那段基因的部分。這個ldea的工作量比之前所有實驗的工作量都大很多，但在此時，任何新的想法都是值得一試的。

令人驚喜的是，這一次，我們成功了。

雌雄畢方

當(dāng)這只編號為BEFUN-Ⅲ-0917的雌性單足小畢方真的出現(xiàn)在大家面前的時候，每位研究員都屏住了呼吸，生怕吵到這個眼睛還沒睜開的小家伙。

在它腹部的正下方，那條小小的健康的腿，令所有人都心潮澎湃。

我的團(tuán)隊很快得到了九只小畢方，美中不足的是這九只均為雌性。我猜想是雄鳥基因兼容性較差。由于鳥類的性染色體跟人類相反，雌性為ZW，雄性為ZZ，所以雄性火烈鳥的染色體天然對稱性高，對不對稱的基因編輯的兼容性低。

不過，提高兼容性，有現(xiàn)成的辦法。早在兩百多年前對小白鼠的孤雄生殖研究中，中國團(tuán)隊就用觀察畸形部位的方式來逆向推出非兼容的基因位點，進(jìn)行定向融除。在分析了600多只雄性火烈鳥基因編輯的失敗案例后，我們最終確定了7個位點。在把這7個位點定向敲除后，我們得到了健康的雄性畢方。

隨后，我們采取人工培育的方式，篩選出下肢強(qiáng)大的畢方，進(jìn)行人工繁殖，徹底解決了其下肢孱弱的問題。在人工培育的過程中，我們嘗試用畢方跟火烈鳥進(jìn)行交配繁殖，得出的結(jié)論是鳥卵無法正常孵化。這也就意味著，我們造出來的畢方，不會給生態(tài)帶來任何影響。

燃燒的火紅軀體

然而，現(xiàn)在的畢方，除了擁有強(qiáng)健的單足，似乎還差點什么。盡管我們在喂養(yǎng)它們時單獨補(bǔ)充了蝦青素，但畢方的羽毛顏色也只是比火烈鳥更紅一些而已。直到某一天，李劍突然從自己發(fā)光的寵物金魚身上得到了靈感，激動地跑來向我描述紅色的畢方配上紅色的熒光蛋白，一定會像火焰般美麗。

讓生物發(fā)光是件有趣的事。早在1994年，著名化學(xué)家、諾貝爾化學(xué)獎獲得者錢永健就開始研究改造GFP。后來，俄國科學(xué)院生物有機(jī)化學(xué)研究所的SergeyA.Lukyanov實驗室也從一只顏色深紅的?？锇l(fā)現(xiàn)了深紅色熒光蛋白。而這與火焰相似的顏色，正是我們需要借助的。

在生物體中的實驗表明，深紅色熒光蛋白對生物體組織的穿透性遠(yuǎn)勝于其他顏色，但唯一的缺點就是穩(wěn)定性不高。以往的應(yīng)用都是把蛋白注射到哺乳動物體內(nèi)，可到了畢方這里，紅色熒光蛋白很快就會被降解。我們曾給畢方專門注射過深紅色熒光蛋白，并且在傍晚時分的展示中得到了震撼的視覺效果。有經(jīng)驗的飼養(yǎng)員對畢方鳥群進(jìn)行驚嚇刺激，在腎上腺素的作用下，畢方鳥群像是一團(tuán)燃燒的火。驗收實驗成果的劉老板呆呆地放下望遠(yuǎn)鏡，嘴中喃喃道：“像火，真的像火！”沉默良久，老頭贊嘆說：“可不就是‘見則其邑有訛火嗎！”然而代謝的加速也讓紅色熒光蛋白的降解變快，耀眼的火紅在十幾分鐘內(nèi)便消失了，天地一片空寂，除了畢方偶爾發(fā)出的響聲。

要解決這個問題，還是得用基因工程來編碼染色體，讓它能自己制造紅色熒光蛋白。幾乎所有熒光蛋白的氨基酸序列和折疊方式都是已知的，包括深紅色熒光蛋白的。我們在體外合成了大量這類DNA鏈條，把這段蛋白導(dǎo)入細(xì)胞。在接下來的實驗中，實驗小組分為了兩個方向：一組嘗試讓其全身產(chǎn)生紅色熒光蛋白，另一組則是令其羽毛產(chǎn)生紅色熒光蛋白。然而基因編碼后的畢方?jīng)]有長出具有紅色熒光蛋白的羽毛，我們猜測，在畢方鳥表皮細(xì)胞進(jìn)行角質(zhì)化衍生時（也就是長毛的時候），相關(guān)的角質(zhì)化蛋白與紅色熒光蛋白在功能上不兼容。

我們又把方向轉(zhuǎn)向了蝦青素。蝦青素是一種類胡蘿卜素，本身呈深粉紅色，具有極強(qiáng)的抗氧化性。它的特點之一是與不同的蛋白結(jié)合，變成青色、藍(lán)色。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，畢方在基因改造后的特異蛋白與蝦青素結(jié)合強(qiáng)烈，但可惜并未造成顏色的改變。

由于熒光蛋白所需能量直接來自氧氣，所以如果我們能像血紅蛋白那樣，加入亞鐵使之絡(luò)合到目標(biāo)蛋白上，是不是有可能讓原本的紅色變?yōu)榭梢园l(fā)光的紅色？我提出了這個想法。在提高了畢方血液中的亞鐵離子濃度后，畢方的羽毛終于發(fā)出了紅色的熒光。

意料之外的事情

這個世界上沒有簡單的事情，如果你覺得簡單，多半是因為你還不夠了解。

隨著第一批畢方漸漸長大，我們發(fā)現(xiàn)了很多意料之外的事情。

一是畢方太大了。真的是太大了！第一代畢方，全都是雌性，基本還能保持正?；鹆银B大小，高一米左右，體重六七斤。但開始雌雄合群正常生育之后，畢方的子代便一代比一代大。僅用了十年，三代過后，畢方已經(jīng)有兩米高，五十斤重了。我們對第三代的畢方進(jìn)行了長期跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)它們身體中生長激素對于性激素的響應(yīng)比正常動物慢半拍。對幾乎所有高級動物而言，性激素都會抑制生長激素的分泌。所謂成年，就是性成熟，也就標(biāo)志著體型不再變大。但對畢方而言，大概是編碼后的冗余DNA也有少量解碼，編譯成為新的蛋白，而這種蛋白具有提高生長激素抑制閾值的作用，所以我們觀察到性成熟的畢方在體型上仍然可以增長約30%。最終，我們得到了人類見過最大型的會飛的鳥。

二是畢方很酸。鳥類的氮元素代謝跟哺乳類不同：哺乳類氮元素是變?yōu)槟蛩?，鳥類是變?yōu)槟蛩??？僧叿接捎隗w型太大，食物攝入量高，單靠尿酸搞不定，竟然自身進(jìn)化出硝酸。在第三代畢方?jīng)]有性成熟時，飼養(yǎng)員多次被畢方吐出的酸水燒傷，鳥蓬也很快腐朽不堪。我們趕緊定制了高聚物的鳥蓬，把小畢方轉(zhuǎn)移進(jìn)去。

當(dāng)吐酸水的畢方長到兩米高的時候，我們決定對它們進(jìn)行雌雄分籠，再這么下去，誰也不敢保證，這家伙會不會戳破新做的家。

第三個說起來有點尷尬。畢方鳥具有富集放射性元素的能力，這是我們未曾料到的。而這還是在一次偶然的契機(jī)下，有人用膠片機(jī)拍攝畢方，底片卻莫名其妙地被曝光。后來我們發(fā)現(xiàn)，底片之所以被曝光，是因為遭受了放射性照射。

人類目前已知的所有物種似乎并不存在這種能力，但放射性元素在生物體的不同器官中確實可以富集。以人體為例，進(jìn)入血液中的放射性碘，約70%存在于血漿中，30%很快轉(zhuǎn)移到體內(nèi)各組織器官內(nèi)，且呈高度不均勻分布。大部分放射性碘都選擇性地富集于甲狀腺，這導(dǎo)致在正常情況下，甲狀腺內(nèi)放射性碘的濃度可達(dá)血漿濃度的25倍，在供碘不足的情況下，其濃度可達(dá)到血漿濃度的500倍。所以，放射性碘對人體的危害主要表現(xiàn)為甲狀腺輻射損傷。醫(yī)學(xué)上也正是利用了碘在甲狀腺中的富集行為，通過放射性碘-131治療甲狀腺疾病。

然而，畢方卻是全身富集各類放射性元素。目前唯一可以確定的是，這與畢方的年齡和攝入物有關(guān)，未來可以朝著這個方向繼續(xù)深究。

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紅色并不是火烈鳥本來的羽色，而是來自其攝取的浮游生物。2008年荷蘭萊頓大學(xué)的科學(xué)家弗朗西斯科·布達(dá)（Francesco Buda）教授和他的實驗小組，通過精確的量子計算手段發(fā)現(xiàn)火烈鳥、三文魚、蝦、蟹等呈現(xiàn)出誘人的鮮紅色的原因——蝦青素。蝦青素（Astaxanthin，簡稱ASTA）是一種天然抗氧化劑，在蝦、蟹、鮭魚、藻類等海洋生物身上可找到?；鹆银B通過食用蝦、魚、藻類、浮游生物等傳遞ASTA，使原本潔白的羽毛透射出鮮艷的紅色。

實驗手機(jī)

進(jìn)入生物研究領(lǐng)域以來，我?guī)缀趺繒r每刻都在感嘆自然萬物的偉大。我們能想到、能見到的干奇百怪的生物，說到底都依賴DNA或RNA來遺傳。所有生物的能量，也都來自線粒體制造的ATP。連我們造出的畢方，也無非是在為自然的偉大增加新的注腳。

有個秘密我誰也沒告訴。在看到小畢方的那天晚上，我失眠了，但我很快樂。躺在床上，我越想越興奮。我真實地感覺自己是站在一群巨人的肩上。

CRISPR技術(shù)最早來自對單細(xì)胞生物的研究。人類有免疫系統(tǒng)，那么單細(xì)胞的細(xì)菌靠什么來免疫呢？答案就是CRISPR，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列。這些重復(fù)的序列，可以通過切斷RNA和DNA的方式來對入侵的病毒進(jìn)行抵抗。細(xì)菌的邏輯很簡單，啟動入侵DNA的細(xì)胞凋亡通路。所以CRISPR離不開自己的好基友Cas，這是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白，平時沉默，一旦被激發(fā)，就跟CRISPR一起把指定的DNA切斷。跟DNA、RNA、ATP一樣，CRISPR也是大自然手中的一支畫筆。

Befun項目的實現(xiàn)，利用了CRISPR，但不代表我們沒有在這個基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。實際上，基因編輯并不是簡單的基因改寫，我們幾乎綜合了當(dāng)時所有最先進(jìn)的生物技術(shù)。比如，我們還加入了基因沉默技術(shù)。當(dāng)然，這依然是從人類封印的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒中得到的靈感。

在項目進(jìn)行中，我經(jīng)常會覺得自己踩著前人的腳步一路回溯，最終看到了生命的起點，看到了自然萬物手中的那幾支畫筆。利用這些技術(shù)，我們一步步實現(xiàn)了最初的設(shè)想。盡管在制造過程中遇到了許多行不通的路，但對科學(xué)的探索信仰支撐著我們堅持下來，最終造出了傳說中的神鳥畢方。