自噬的分子機制及其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用△

孫洪巖 滕巖 楊明明

近年來，隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活水平的提高，全球糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率逐年上升，已成為全球威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一[1]。截止到2015年，全球范圍內(nèi)，每11名成年人中就有1人患有DM(共計4.15億)，DM患病率高達8.8%[2]。通過交錯復雜的分子機制，DM可引起諸多微血管損害，其中，以糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)最為常見，且危害最大。作為重要的致盲眼病，DR相關研究一直是眼科學界及內(nèi)分泌領域研究的熱點。臨床已發(fā)現(xiàn)高血糖、高血壓、高血脂等是DR發(fā)病的危險因素，諸多信號轉(zhuǎn)導通路參與其中，但DR確切的分子機制及致病機制至今尚未完全闡明[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為機體重要的防御反應機制，參與了DR的發(fā)生發(fā)展，與氧化應激及缺氧等途徑密切相關[5]。因此，本文對自噬的分子機制及其在DR中的作用進行綜述。

1 自噬及其分子機制

自噬是一種重要的體內(nèi)細胞平衡過程，通過溶酶體系統(tǒng)代謝胞質(zhì)蛋白來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，包括一系列連續(xù)的步驟，對于降解和循環(huán)細胞物質(zhì)是必不可少的[6]。自噬是進化上相對保守的分解代謝過程，其允許去除溶酶體中的胞質(zhì)蛋白和功能性細胞器降解?；旧希允墒且环N適應性反應，在壓力條件下，保證了衰老和受損細胞器的生理循環(huán)，從而通過各種交叉信號控制細胞的命運[7]。在機體新陳代謝的過程中，自噬有以下作用：自噬可以維持蛋白質(zhì)和細胞器周轉(zhuǎn)之間的平衡，其降解的產(chǎn)物可以提供物質(zhì)能量循環(huán)；自噬可以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；另外，自噬不但能夠清除細胞質(zhì)內(nèi)病原體，影響先天性免疫和適應性免疫，而且可以對亞細胞水平進行重新構造，對已經(jīng)受損的細胞實施保護；同時也可以引誘細胞的主動性滅亡[8-9]。

1.1 自噬的分類由于細胞物質(zhì)進入溶酶體內(nèi)的途徑不同，迄今為止，自噬的主要類型可分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介紹的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)[10]。具有代表性的是巨自噬，它是細胞降解胞質(zhì)聚集蛋白和受損細胞器分解溶酶體的途徑，由自噬體與溶酶體融合成自溶酶體，進而降解其內(nèi)容物的過程。受饑餓等刺激時，細胞可發(fā)生微自噬，即細胞質(zhì)內(nèi)容物被溶酶體直接嵌入，形成單膜囊泡并迅速降解[11]。而分子伴侶介導的自噬僅存在于哺乳動物細胞中，由胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化[12]。與前兩種不同，CMA是一種獨特的自噬選擇性形式，通過這種方式，特定的胞質(zhì)蛋白逐個通過溶酶體膜進行降解。

1.2 自噬的調(diào)節(jié)及信號轉(zhuǎn)導途徑自噬的調(diào)節(jié)機制是非常復雜的，涉及許多通路在不同步驟的配合，而雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的起始階段[5]。mTOR存在2種不同的信號復合物，mTORC1和mTORC2，前者與自噬的關系更為緊密。而氨基酸的攝入程度、細胞的能量狀況均可以調(diào)控mTORC1的活性。當細胞缺失葡萄糖時，ATP/AMP值降低，為獲取能量，AMP活化蛋白激酶(AMPK)的自噬系統(tǒng)就會啟動。而mTOR是AMPK的作用底物，可以通過影響mTOR的活性來調(diào)節(jié)自噬的水平[13]。自噬的信號轉(zhuǎn)導途徑主要有mTOR、PI3K/Akt、ROS、NF-kB等信號轉(zhuǎn)導通路，此外，Ras/蛋白激酶A(PKA)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變蛋白激酶(ATM)等信號轉(zhuǎn)導通路也與自噬的發(fā)生密切相關[14]。

1.3 自噬相關基因與自噬有關的基因多種多樣，基因在不同的領域范疇均有體現(xiàn)。自噬相關基因(Atg)是自噬的核心分子機制，它可以介入隔離膜的構成、細胞質(zhì)的吞噬、自噬小泡的構成和溶酶體的融合。部分自噬相關基因在自噬中的功能見表1[15-26]。

表1 部分自噬相關基因在自噬中的功能

2 自噬與DR的相關性研究

2.1 自噬與氧化應激氧化應激在DR的發(fā)生、進展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。高糖是DR的主要危險因素，它可以引起線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加，促進氧化應激，誘發(fā)病理性自噬，導致血管內(nèi)皮細胞的損傷。視網(wǎng)膜上有大量不飽和脂肪酸，其攝氧量和葡萄糖的氧化作用都相對較其他組織高，故視網(wǎng)膜對氧化應激尤其敏感。氧化應激產(chǎn)生于ROS的產(chǎn)生與消除之間的不平衡。正常情況下，代謝產(chǎn)生的ROS均能被清除系統(tǒng)清除，但當ROS產(chǎn)生過多時，平衡機制失調(diào)，引起組織損傷、線粒體堆積、細胞功能失調(diào)或凋亡等，進而發(fā)生氧化應激性損傷[27]。氧化應激能誘導線粒體自噬，并且可以在一定程度上通過對受損線粒體清除的方式來對細胞進行保護[28]。DR患者ROS程度升高，增加的ROS會進一步損害線粒體DNA和蛋白，進而改變電子傳遞鏈，電子傳遞鏈會連續(xù)產(chǎn)生大量ROS，從而發(fā)生惡性循環(huán)，引發(fā)DR的氧化應激性損傷。ROS可誘導細胞過度自噬，外源性H2O2可激活PERK，抑制mTOR活性，誘導自噬。尤其是在饑餓狀態(tài)下，H2O2可以將自噬相關基因Atg4氧化后，抑制LC3-Ⅱ去脂化，保證自噬體的形成，進而使毛細血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡和壞死，引起血管損傷，造成視網(wǎng)膜缺血缺氧，導致視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管形成、纖維化和視網(wǎng)膜脫離等，從而引發(fā)DR[29]。同時氧化應激也介入了其他與DR密切相關的代謝通路，如多元醇、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、蛋白激酶C(PKC)途徑等。以上機制的配合介入，彼此交織，影響了DR的發(fā)生和發(fā)展。

2.2 自噬與視網(wǎng)膜新生血管形成血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是內(nèi)皮細胞最具有特異性的生長因子，可以誘導血管生長。視網(wǎng)膜毛細血管局部缺氧致使VEGF水平升高，VEGF的釋放導致病理血管生成不規(guī)則和結(jié)構異常，促使血管通透性增加，血管容易滲漏，導致液體在視網(wǎng)膜堆積，新生血管生成。因新生血管無正常的管壁結(jié)構，極易出血并導致視力下降，進而引發(fā)血管瘢痕化萎縮，造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離等。因此，VEGF在DR中扮演非常重要的角色，也是現(xiàn)階段DR治療的重要靶點之一。最新研究表明，高血糖可上調(diào)自噬底物(p62/SQTSM1)的表達水平，誘導VEGF大量釋放及Müller細胞的代謝性死亡。這表明，溶酶體功能障礙和自噬調(diào)控異常在DR早期即有參與[19]。王慷慨等[30]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VEGF處理可顯著增加Beclin-1、ATG4、ATG5、LC3-Ⅱ等自噬基因的表達，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理后則抑制了VEGF介導的HUVECs管型形成和細胞遷移能力，表明VEGF可以通過自噬誘導內(nèi)皮細胞管型的形成，進而影響DR的發(fā)生與發(fā)展。此外，通過猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的體外實驗發(fā)現(xiàn)，高糖能夠激活內(nèi)皮細胞自噬，促進體外新生血管形成，通過抑制自噬能夠抑制細胞遷移和管腔構建[31]。這些研究均表明，自噬參與了DR新生血管的形成。同時，也為自噬成為眼底新生血管性疾病治療的新靶點提供了可能。

2.3 自噬與缺氧缺氧在DR中的作用已得到廣泛認可，微血管細胞的損害導致微血管擴張、滲漏，進而微血管閉塞，視網(wǎng)膜出現(xiàn)大片無灌注區(qū)，導致視網(wǎng)膜缺血缺氧，進而產(chǎn)生新生血管。而缺氧誘導因子1α(hypoxia induction factor-1α，HIF-1α)是在缺氧環(huán)境條件下被激活且能穩(wěn)定存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，缺血缺氧可以誘導HIF-1α的表達，進而促進VEGF的激活，對DR中新生血管的形成極其重要。HIF可上調(diào)促自噬蛋白(BNIP3和BNIP3L)的表達，繼而將Beclin1從Bec-2蛋白的結(jié)合中釋放出來，被激活的Beclin1可參與到自噬體形成中，誘導自噬發(fā)生。反之，當BNIP3和BNIP3L敲除時，自噬會顯著減少[32]。DR患者長期受ROS、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，氧化應激通過ROS-HIF-1α-VEGF-VEGFR2信號通路或直接通過ROS-VEGFR2通路，均可導致新生血管的生成。組織缺氧可以控制HIF-1可羥基化和調(diào)節(jié)蛋白的水平和活動[33]。在DR中，HIF-1α與VEGF的表達息息相關，同時與氧化應激也極為密切。有研究表明，Akt活化后通過其兩種下游分子HDM2和p70S6K1來誘導HIF-1α和VEGF表達，而mTOR作為Akt信號通路的重要下游因子，通過參與Akt通路可以誘導HIF-1α和VEGF的產(chǎn)生[34-35]。mTOR可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α，進一步調(diào)節(jié)VEGF以影響新生血管生成，促進細胞增殖。但mTOR通過HIF-1α和VEGF參與到DR病理生理過程的確切機制還有待進一步研究。

2.4 自噬與胰島B細胞的損傷高血糖是DR的高危因素，它可以使視網(wǎng)膜毛細血管大量閉塞，視網(wǎng)膜組織缺乏血液供應，出現(xiàn)營養(yǎng)失衡，造成視網(wǎng)膜缺血缺氧，引起DR。胰島B細胞功能下降是2型DM的主要機制，它取決于B細胞的數(shù)量和B細胞分泌胰島素的本領。而自噬是體內(nèi)外應激的主要機制之一，在維持胰島B細胞活性及數(shù)量中有重要作用。在病理條件下，胰島素抵抗程度增加，胰島B細胞自噬水平也隨之提高，進而胰島B細胞受到保護，防止其死亡。Liang等[36]研究證實，在自噬缺損的胰島B細胞中，線粒體功能會發(fā)生異常，ATP和NADPH2產(chǎn)生減少，進而誘導細胞凋亡和細胞周期的阻滯。因此，激活自噬，清除受損線粒體，增強線粒體的功能，從而改善胰島素抵抗是細胞避免損傷的重要機制。

2.5 自噬與脂質(zhì)代謝紊亂DM患者常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常。當機體代謝異常時，體內(nèi)抗氧化物質(zhì)發(fā)生過度消耗，導致抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱，使低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)易被氧化成氧化型LDL(oxidized-LDL,ox-LDL)。LDL的氧化，對視網(wǎng)膜微血管造成了一定程度的損傷，如出血、滲出、微血管瘤等視網(wǎng)膜微血管病變，與疾病的嚴重程度成正比。在增殖型DR中，ox-LDL存在于所有視網(wǎng)膜層，與巨噬細胞共存。ox-LDL可以促進VEGF的表達，進而加快視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞的增生，導致新生血管的形成，加快DR的發(fā)展[37]。ox-LDL可以誘導巨噬細胞發(fā)生自噬，在自噬被抑制后，自噬介導的細胞質(zhì)脂滴向溶酶體轉(zhuǎn)化，水解成游離的膽固醇排出[38]。但ox-LDL通過自噬如何影響DR的機制還比較模糊，需進一步闡明。

3 自噬在DR中的調(diào)節(jié)機制

自噬在DR中具有不可替代的作用，因此，對自噬在DR中機制的研究也就顯得特別重要。mTOR是一種控制細胞生長和代謝的細胞質(zhì)激酶，是細胞生長和增殖的關鍵調(diào)控因子，可以控制細胞生物能量增長或減弱。在DR中，mTOR 在誘導自噬的信號轉(zhuǎn)換中起核心作用，尤其是mTOR復合體1(mTORC1)。ULK-Atg13-FIP200復合物介導的自噬調(diào)控途徑是mTORC1的直接靶蛋白，對自噬的啟動有重要作用。mTORC1通過磷酸化Atg13使其不能與Atg1結(jié)合形成自噬體，從而阻斷自噬，mTOR抑制劑雷帕霉素(RAPA)可阻斷上述途徑而誘導自噬發(fā)生[39]。除mTOR調(diào)節(jié)機制外，有研究證實，Class Ⅲ PI3k可通過與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合形成有活性復合物而促進自噬形成[40]。此外，亦有AMPK直接磷酸化ULK1及脫乙酰酶Sirt1等多種自噬激活途徑參與其中[41]。

4 自噬在DR中的臨床應用及前景

自噬在DR的發(fā)生發(fā)展中起至關重要的作用。氧化應激、炎癥等均可誘導自噬，而mTOR信號通路是自噬的主要通路。雷帕霉素是mTOR的抑制劑，可以對抗DM誘導的氧化應激損傷，從而減少調(diào)節(jié)血管生成的細胞因子[42]。同時，雷帕霉素還可抑制HIF-1α和視網(wǎng)膜細胞的衰老，從而破壞視網(wǎng)膜和脈絡膜的新生血管。但雷帕霉素在DR的研究目前只存在于動物實驗階段，還未在臨床應用中展開。期望它有望成為治療新生血管的新藥。同樣，HIF-1α能誘導VEGF的激活，導致新生血管的形成，因此，深入闡明HIF-1α與自噬在DR中的作用機制及關系，有助于進一步闡明DR的發(fā)病機制，找尋更有效的臨床藥物靶點，為DR患者帶來新的曙光。