鐵皮石斛種子共生萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察*

張 盈 李媛媛 陳曉梅 郭順星

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

0 引 言

蘭科植物是被子植物中最大、最進(jìn)化的家族之一，許多種類具有較高的藥用、觀賞價(jià)值，如天麻(gastrodiaelata)、鐵皮石斛(dendrobiumofficinale)、福建金線蓮(anoectochilusroxburghii)、蝴蝶蘭(phalaenopsisaphrodite)等．蘭科植物種子微小、沒有胚乳，構(gòu)造簡單的種皮中包裹著一個(gè)未分化的胚[1]，因此，蘭科植物種子自身無法提供充足的營養(yǎng)以啟動(dòng)萌發(fā)．在自然條件下，種子必須與合適的菌根真菌建立共生關(guān)系才能夠完成早期發(fā)育，這一特殊的萌發(fā)過程被稱為共生萌發(fā)(symbiotic germination)[2]．由于極低的自然繁殖率、獨(dú)特的生存環(huán)境，以及人類對蘭科植物生存環(huán)境的破壞和資源的過度利用，導(dǎo)致其處于瀕危狀態(tài)，野生自然資源幾近枯竭．采用人工培養(yǎng)基進(jìn)行種子非共生萌發(fā)是生產(chǎn)蘭科植物種苗的主要來源[3]．這種繁殖方式效率高，但獲得的幼苗往往十分脆弱，移栽后生長緩慢、存活率低、易感染病害[4]．隨著蘭科植物種子共生萌發(fā)研究的開展，科研工作者和業(yè)內(nèi)人士開始認(rèn)識到其優(yōu)勢．與非共生萌發(fā)相比，共生萌發(fā)得到幼苗的周期短，并且幼苗在萌發(fā)階段就與菌根真菌建立共生關(guān)系，能夠提高移栽成活率，有利于瀕危植物回歸自然生存環(huán)境[5]．此外，菌根真菌還能保護(hù)種子免受其他微生物的侵害，提高抗逆性．這些特點(diǎn)吸引了越來越多的學(xué)者對蘭科植物種子共生萌發(fā)進(jìn)行深入研究．

蘭科植物種子和共生萌發(fā)形成的原球莖體積很小，肉眼不易觀察．雖然有關(guān)共生萌發(fā)的報(bào)道很多，但形態(tài)學(xué)方面的研究很有限．目前最常用的方法是在體視鏡下觀察共生萌發(fā)過程的各個(gè)階段，進(jìn)一步檢測種子和原球莖是否被菌根真菌侵染，則采用石蠟切片、半薄切片和超薄切片方法進(jìn)行觀察[6-11]．切片觀察操作復(fù)雜，且周期較長．能否借鑒其他菌根共生形態(tài)學(xué)研究方法，找到一些操作簡單，耗時(shí)短的觀察方法應(yīng)用于蘭科植物種子共生萌發(fā)，檢測菌根真菌在種子和原球莖中的定殖是值得研究的問題．鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有重要的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[12]．本課題組經(jīng)過多年研究，建立了鐵皮石斛種子-膠膜菌屬菌根真菌共生的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)體系[13]．因此，本研究以該共生體為實(shí)驗(yàn)材料，利用多種真菌特異性染劑結(jié)合顯微觀察儀器，以期為蘭科植物種子共生萌發(fā)提供簡單高效的檢測方法，為蘭科植物種子共生萌發(fā)機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究．

1 材料與方法

1.1 植物材料與供試菌株

鐵皮石斛成熟蒴果于2018年12月采自云南西雙版納．促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)的菌根真菌為膠膜菌屬真菌(Tulasnellasp)S6(純培養(yǎng)時(shí)具有念珠狀細(xì)胞，在侵入種子的菌絲中不存在)，分離自金釵石斛成年植株根部[13]．

1.2 試劑

磷酸鹽吐溫(PBST)緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)：1 000 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)加入1 mL 吐溫20．

Hoyer′s 溶液：7.5 g 阿拉伯樹膠、100 g 水合三氯乙醛、5 mL 甘油、60 mL 蒸餾水，在磁力攪拌器上混合均勻，直至溶液變透明．

苯胺藍(lán)(aniline blue)、氯唑黑E(chlorazol black E)和臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue，0.05% w/v)：分別取3種染劑粉末100 mg添加到 100 mL 乳甘油(乳酸 ∶甘油 ∶水=1∶1∶1，v/v/v)溶液中．

麥胚凝集素-異硫氰酸熒光素(wheat-germ agglutinin-fluorescein isothiocyante，WGA-FITC)染劑(100 μg/mL)：1 mg WGA-FITC粉末加入到1 mL PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中，使用時(shí)稀釋10倍，至100 μg/mL．

1.3 培養(yǎng)基

共生萌發(fā)(oatmeal agar，OMA)培養(yǎng)基[14]：4 g/L燕麥粉+9 g/L瓊脂，pH 5.2～5.6．

菌株活化(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基[15]：200 g/L去皮土豆+20 g/L葡萄糖+12 g/L瓊脂．

1.4 鐵皮石斛種子共生萌發(fā)

參照Li等[14]的方法進(jìn)行共生萌發(fā)操作． 首先將成熟未開裂的鐵皮石斛果實(shí)在自來水下沖洗10～20 min，濾紙吸干多余水分后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)．然后用70%乙醇處理1 min，轉(zhuǎn)移到2.5%次氯酸鈉溶液中處理10～15 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干多余水分．最后將消毒的果實(shí)用無菌手術(shù)刀剖開，取出種子，保存在無菌離心管中用于播種．在OMA培養(yǎng)基中間放置一塊4 cm ×4 cm 無菌尼龍布(300目)，尼龍布4個(gè)邊緣分別接種1塊0.5 mm S6真菌PDA組織塊，然后將無菌鐵皮石斛種子均勻播在尼龍布上，共播種60皿．石蠟?zāi)し饪?，光培養(yǎng)室培養(yǎng)．光照周期為12 h/12 h(光/暗)，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，溫度(25.0±2.0)℃．另設(shè)不接菌播種的鐵皮石斛種子10皿作為對照組．每周于體視顯微鏡下觀察并拍照，記錄種子萌發(fā)情況．種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育參照Stewart等[16]的劃分標(biāo)準(zhǔn)．分別于發(fā)育階段0～5級時(shí)取樣，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察．

1.5 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察

收集0～5級的種子和原球莖，不做處理，直接粘在銅制樣品臺(tái)上．EIKOIB-3型金離子濺射儀表面噴涂(日本，EIKO)．HITACHIS-3400 N型掃描電子顯微鏡(日本，日立高新技術(shù)公司)觀察并照相．

1.6 真菌特異性染色觀察

WGA-FITC染色觀察：分別收集0～3級的種子和原球莖于離心管中，PBST緩沖液沖洗3次，每次5 min．然后用WGA-FITC(100 μg/mL)染劑室溫避光染色90 min．PBST緩沖液沖洗3次，每次10 min．用移液器和尖頭小鑷子將種子和原球莖輕輕轉(zhuǎn)移到載玻片上，濾紙吸去多余的水分．滴加3～4滴抗熒光衰減封片劑，將種子和原球莖分散均勻，使之處于同一平面．封片后，在LSM510型(德國，蔡司)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)下觀察并拍照．另設(shè)對照組，不做WGA-FITC染色處理．

苯胺藍(lán)、氯唑黑E和臺(tái)盼藍(lán)染色觀察：分別收集0～5級的種子和原球莖于離心管中，加入適量10% KOH溶液，90℃水浴 30 min．用吸管吸去10%KOH溶液，去離子水沖洗3次．分別加入苯胺藍(lán)、氯唑黑E和臺(tái)盼藍(lán)(0.1%w/v)3種染劑，90℃水浴15～20 min．吸去染劑，加入50%甘油室溫脫色3次，每次5 min．光學(xué)顯微鏡觀察并拍照．另取1和2級萌發(fā)階段的種子和3～5級的原球莖徒手切片，室溫條件下，臺(tái)盼藍(lán)染色15 min．去離子水沖洗掉表面浮色(未與原球莖結(jié)合的菌絲)后，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照．

1.7 Hoyer′s溶液透明觀察

滴少許Hoyer′s溶液在5個(gè)載玻片上，分別在液滴中放入1～5級的種子和原球莖．蓋上載玻片，根據(jù)樣品大小，室溫放置24 h后，微分干涉(differential interference contrast microscope，DIC)顯微鏡(中國，上海光語生物科技有限公司)觀察并拍照．

2 結(jié)果與討論

2.1 宏觀形態(tài)研究

鐵皮石斛種子共生萌發(fā)0～5級種子和原球莖的體視鏡圖如圖1所示．成熟的鐵皮石斛種子聚集在蒴果中，呈黃色粉狀、長梭形，胚位于種皮中央，為0級萌發(fā)階段；共生播種1周時(shí)，種子吸水膨脹，胚體積變大，種皮仍舊保持完整，進(jìn)入1級萌發(fā)階段；共生播種2周時(shí)，可見種胚繼續(xù)膨大，呈紡錘形，種子已經(jīng)撐破種皮，進(jìn)入2級萌發(fā)階段；共生播種3周時(shí)，形成淡綠色透明的球形原球莖，此時(shí)原球莖頂端分生組織處形成明顯突起(盾片)，基部則出現(xiàn)大量的假根，進(jìn)入3級萌發(fā)階段；原球莖繼續(xù)發(fā)育，共生播種4周時(shí)，盾片不斷伸長，進(jìn)入4級萌發(fā)階段；到了第8周，第1片葉從盾片對面長出，進(jìn)入5級萌發(fā)階段；不加菌的對照組到第8周時(shí)，停留在2級萌發(fā)階段，不再進(jìn)一步發(fā)育．

圖1 鐵皮石斛種子共生萌發(fā)0～5級種子和原球莖的體視鏡圖(a) 0級；(b) 1～3級；(c) 4～5級

圖2 鐵皮石斛共生種子和原球莖的掃描電子顯微鏡圖(a) 0級；(b) 1級；(c) 2級；(d) 3級；(e) 4級

2.2 微觀形態(tài)研究

鐵皮石斛共生種子和原球莖的SEM圖如圖2所示．由圖可觀察，0級萌發(fā)階段，種子呈紡錘形，種胚被種皮緊密包圍，表面紋飾為不規(guī)則長形條紋；進(jìn)入1級萌發(fā)階段，種皮被膨大的胚撐開，菌根真菌的菌絲密集于種子周圍，覆蓋于種皮表面呈網(wǎng)狀；菌絲從種皮任意部位侵入種子內(nèi)部，并不斷產(chǎn)生分支，緊密依附在胚體表面；進(jìn)入2級萌發(fā)階段，發(fā)育的胚突破種皮，并開始出現(xiàn)假根，菌絲附著在裸露的胚體上；進(jìn)入3級萌發(fā)階段，形成頂端分生組織突起的原球莖，基部產(chǎn)生大量的假根，胚體表面出現(xiàn)氣孔，但未見菌絲依附在原球莖表面；進(jìn)入4級萌發(fā)階段，盾片繼續(xù)伸長，原球莖基部分化出大量的假根，胚體表面未見菌絲存在．

2.3 真菌特異性染色

2.3.1WGA-FITC染色觀察

1～3級萌發(fā)階段的種子和原球莖經(jīng)WGA-FITC染色后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下能清楚觀察到菌絲在種子和原球莖中的定位以及熒光信號的強(qiáng)弱(圖3)．1級萌發(fā)階段，熒光信號在種胚珠孔端強(qiáng)烈表達(dá)，種皮有微弱自發(fā)熒光；2級萌發(fā)階段，熒光信號主要集中在原球莖基部，此時(shí)菌絲以菌絲團(tuán)的形式分布在胚細(xì)胞內(nèi)；3級萌發(fā)階段，熒光信號依然只分布在原球莖基部，與2級萌發(fā)階段相比，菌絲團(tuán)數(shù)量增多，基部假根有自發(fā)熒光．對照組未見原球莖基部的菌根真菌定殖部位有明顯熒光信號．

圖3 鐵皮石斛共生種子和原球莖WGA-FITC染色觀察(a)-(c) 1級；(d)-(f) 2級；(g)-(i) 3級

2.3.2苯胺藍(lán)、氯唑黑E和臺(tái)盼藍(lán)染色觀察

鐵皮石斛共生種子和原球莖真菌特異性染劑染色光鏡圖如圖4所示．由圖可知苯胺藍(lán)特異性的將菌絲染成藍(lán)色．1級萌發(fā)階段的種子胚柄端可觀察到藍(lán)色的菌絲和菌絲團(tuán)；2級萌發(fā)階段的原球莖基部藍(lán)色菌絲團(tuán)的數(shù)目增多，種子周圍的菌絲也被染成藍(lán)色；藍(lán)色的菌絲團(tuán)由菌絲相互纏繞在一起形成球狀．氯唑黑E特異性的將菌絲染成黑色．1級萌發(fā)階段的種子胚柄端黑色的菌絲和菌絲團(tuán)清晰可見；2級萌發(fā)階段的原球莖可觀察到正在從胚柄端侵入胚的菌絲，胚體基部黑色的菌絲團(tuán)占細(xì)胞體積的一半；黑色的菌絲纏繞在一起形成菌絲團(tuán)，位于胚細(xì)胞中央．臺(tái)盼藍(lán)特異性的將菌絲染成深藍(lán)色．1級萌發(fā)階段的種子外面圍繞著大量深藍(lán)色的菌絲，胚柄端細(xì)胞內(nèi)可見深藍(lán)色的菌絲和菌絲團(tuán)；2級萌發(fā)階段的原球莖已經(jīng)突破種皮，深藍(lán)色的菌絲團(tuán)主要聚集在種胚基部；球形深藍(lán)色的菌絲團(tuán)位于胚細(xì)胞中央，幾乎占滿整個(gè)細(xì)胞．

圖4 鐵皮石斛共生種子和原球莖真菌特異性染劑染色光鏡圖(a) 苯胺藍(lán)染色的1級種子；(b) 苯胺藍(lán)染色的2級原球莖；(c) 苯胺藍(lán)染色的菌絲團(tuán)；(d) 氯唑黑E染色的1級種子；(e) 氯唑黑E染色的2級原球莖；(f) 氯唑黑E染色的菌絲團(tuán)；(g) 臺(tái)盼藍(lán)染色的1級種子；(h) 臺(tái)盼藍(lán)染色的2級原球莖；(i) 臺(tái)盼藍(lán)染色的菌絲團(tuán)

使用臺(tái)盼藍(lán)對活體種子進(jìn)行染色，其染色結(jié)果如圖5所示．在1級萌發(fā)階段的種子中能夠直觀地看到深藍(lán)色菌絲正在從種子的胚柄端侵入胚，進(jìn)入胚體后定殖在基部．此時(shí)菌絲分布在種子周圍的各個(gè)部位，但除了胚柄端外，未見菌絲在胚體的其他部位侵染和定殖．當(dāng)原球莖分化出假根以后，深藍(lán)色的菌絲能夠穿透假根．

圖5 鐵皮石斛共生種子和原球莖臺(tái)盼藍(lán)染色光鏡圖(a) 臺(tái)盼藍(lán)染色的1級種子；(b) 臺(tái)盼藍(lán)染色的原球莖徒手切片

2.4 Hoyer′s 溶液透明觀察

種子和原球莖經(jīng)過Hoyer′s 溶液透明處理后，在DIC顯微鏡下呈現(xiàn)三維立體結(jié)構(gòu)(圖6)．1級萌發(fā)階段，種皮已經(jīng)被撐開，菌絲聚集在球形胚體的胚柄端進(jìn)入2級萌發(fā)階段，胚體從種皮中脫離，菌絲已形成菌絲團(tuán)，位于胚細(xì)胞中央；胚細(xì)胞中細(xì)胞核以及核仁清晰可見．進(jìn)入3級萌發(fā)階段，原球莖頂端形成突起，分生組織細(xì)胞小而緊密，中部和基部細(xì)胞較大，菌絲團(tuán)主要位于原球莖的基部，未在頂端分生組織部位定殖；4級萌發(fā)階段，原球莖基部的假根發(fā)達(dá)，菌絲團(tuán)被限制在基部少數(shù)幾層細(xì)胞中．

3 討 論

鐵皮石斛是一種附生型的綠色蘭科植物，自然界中種子萌發(fā)必須與合適的菌根真菌建立共生關(guān)系．一旦菌根真菌在胚細(xì)胞中定殖，種子很快發(fā)育成原球莖，并進(jìn)一步分化形成幼苗．形態(tài)學(xué)方法觀察發(fā)現(xiàn)，菌根真菌與種子共生關(guān)系顯示以下規(guī)律：首先菌絲從胚柄端侵入胚細(xì)胞，隨后侵入外皮層細(xì)胞形成菌絲團(tuán)，菌絲繼續(xù)向內(nèi)侵染在內(nèi)皮層細(xì)胞中定殖，并最終在內(nèi)皮層細(xì)胞中形成菌絲塊被消化吸收． Chen等[6]對鐵皮石斛種子共生萌發(fā)的形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步研究，證明鐵皮石斛與地生型蘭科植物綬草(spiranthessinensis)在共生萌發(fā)過程中有類似的超微結(jié)構(gòu)變化．頂端分生組織區(qū)域在原球莖整個(gè)發(fā)育過程中均不被菌絲定殖，這可能與存在植物細(xì)胞壁中的一類富含羥脯氨酸的糖蛋白(hydroxyproline-rich glycoproteins, HRGPs)有關(guān)，HRGPs集中在原球莖基部細(xì)胞的胞壁上，作為潛在的邊界區(qū)域阻止真菌向上侵染，以保證原球莖頂端分生組織的分化和發(fā)育[14]．

微觀研究結(jié)果清晰展示了鐵皮石斛種子共生萌發(fā)各個(gè)級別的三維立體結(jié)構(gòu)．共生萌發(fā)過程中，菌絲直接與種子和原球莖接觸，如果采用傳統(tǒng)方法處理樣品后再使用掃描電子顯微鏡觀察，樣品表面的真實(shí)特征及菌絲分布情況必然發(fā)生改變．為了最大程度保持樣品原貌，本實(shí)驗(yàn)未按照傳統(tǒng)方法對共生的種子和原球莖進(jìn)行處理，而是直接收集新鮮樣品噴金后進(jìn)行觀察．結(jié)果顯示，直接觀察法簡單有效，不足之處是未經(jīng)處理的樣品在真空中容易發(fā)生形變，因此操作時(shí)必須迅速，在短時(shí)間內(nèi)找到要觀察的樣品．盡管如此，直接觀察法被證明是可行的，可用于之后的研究．此外，掃描電鏡結(jié)果顯示菌絲可以從種皮任意位置侵入，但是未能觀察到菌絲在胚體上的侵入位點(diǎn)．分析原因，可能有以下兩點(diǎn)：(1)對共生種子和原球莖進(jìn)行觀察時(shí)，未特別定位在種子的胚柄端和原球莖基部；(2)樣品數(shù)量不夠大，本次實(shí)驗(yàn)僅觀察了15顆種子和原球莖．在后期研究中，應(yīng)增加樣品數(shù)量，并將觀察重點(diǎn)定位在剛接觸菌絲的種子的胚柄端和發(fā)育原球莖的基部．

麥胚凝集素(WGA)與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，常被用來標(biāo)記真菌的細(xì)胞壁[16]．激光掃描共聚焦顯微鏡對活的樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無損傷觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)，得到樣品的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像．WGA-FITC染色結(jié)合CLSM清晰直觀地記錄了菌絲在活體種子和原球莖內(nèi)的定殖情況．結(jié)果顯示，菌絲最初定殖在種子的胚柄端，隨著原球莖的不斷發(fā)育，菌絲從外皮層細(xì)胞擴(kuò)張到內(nèi)皮層細(xì)胞，并以菌絲團(tuán)形式存在于胚細(xì)胞中．整個(gè)發(fā)育過程中，菌絲定殖部位始終限制在原球莖基部．WGA-FITC染色結(jié)合CLSM的觀察方法經(jīng)常被用在菌根共生研究中[17-18]，本實(shí)驗(yàn)在前人方法上進(jìn)行改進(jìn)，首次用于蘭科植物種子共生萌發(fā)觀察，得到很好的結(jié)果．

苯胺藍(lán)、氯唑黑E和臺(tái)盼藍(lán)是3種常見的真菌特異性染色劑，廣泛用于菌根共生研究中[19]．3種染劑分別對共生的種子和原球莖進(jìn)行處理，均得到出色的染色效果．染色的菌絲團(tuán)定殖在原球莖的基部，與其他形態(tài)學(xué)方法得到的結(jié)論一致．此外，臺(tái)盼藍(lán)對活體種子和原球莖徒手切片染色結(jié)果證明菌根真菌可以從胚柄端和假根兩個(gè)位點(diǎn)侵入胚細(xì)胞，這與前人的研究結(jié)果是一致的[8]．只需用這3種染劑對樣品進(jìn)行簡單處理，即可放在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，因此不失為一種快速簡便的檢測蘭科植物種子-菌根真菌共生體的方法．

整體透明技術(shù)是植物生物學(xué)中一種重要的技術(shù)，常用于植物生殖生物學(xué)研究[20-22]．植物組織或器官經(jīng)過各種透明劑處理后，利用微分干涉差顯微鏡，可觀察到通常不易觀察到的組織和細(xì)胞．對一些較小的，制作切片困難的材料，用此法可快速觀察到內(nèi)部組織和結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程．在不破壞整體結(jié)構(gòu)的條件下，對所研究的目標(biāo)作原位的考察．共生的種子和原球莖經(jīng)過Hoyer′s溶液透明后，利用DIC顯微鏡進(jìn)行整體觀察，清楚地觀察到菌絲在細(xì)胞內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)以及定殖情況，操作簡單方便．

本研究在前人基礎(chǔ)上，使用多種形態(tài)學(xué)觀察方法對鐵皮石斛種子-膠膜菌屬菌根真菌共生體這一特殊材料進(jìn)行觀察，得到一系列有價(jià)值的研究結(jié)果．這些方法操作簡單，周期短，為蘭科植物種子共生萌發(fā)的形態(tài)學(xué)觀察提供方法學(xué)上的參考．未來研究中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)材料，選擇合適的方法，用于蘭科植物種子-菌根真菌共生體的觀察．

致謝：感謝中國臺(tái)灣自然科學(xué)博物館李勇毅研究員在技術(shù)方面的指導(dǎo)．