中國健康漢族人基因組DNA中干擾素α1和干擾素α2等位基因組成的測定

王 兵, 楊昊欣, 楊 楠, 鞠泳興, 盧 晨, 程聯(lián)勝, 龔慶國

(1. 安徽省生物研究所， 合肥 230001； 2. 合肥安科精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司， 合肥 230001； 3. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230026)

干擾素(interferon,IFNs)是一類具有廣譜抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性的多功能細(xì)胞因子家族，根據(jù)結(jié)合受體不同，可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素[1]。Ⅰ型干擾素屬于多基因家族，人體內(nèi)共有17個(gè)Ⅰ型干擾素亞型，包括13個(gè)IFNα、1個(gè)IFNβ、1個(gè)IFNε、1個(gè)IFNκ和1個(gè)IFNω[2]。其中，IFNα1和IFNα2是首先發(fā)現(xiàn)和批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的兩個(gè)α干擾素亞型[3]。

迄今為止，人類IFNα1共計(jì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)等位基因，彼此之間僅有兩個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，分別位于IFNα1基因編碼區(qū)的410和541核苷酸位點(diǎn)。人類IFNα1基因有IFNαD、IFNα1和IFNα1/158Val 3個(gè)等位基因[4]。成熟的IFNαD蛋白氨基酸序列114位為纈氨酸殘基(GTG)、158位為亮氨酸殘基(TTG),由Nagata等人于1980年從急性髓系白血病細(xì)胞系(KG-1)cDNA中克隆的[5]。IFNα1蛋白氨基酸序列114位為丙氨酸殘基(GCG)、158位為亮氨酸殘基(TTG)，由Goeddel等人于1981年從人胎肝染色體基因文庫中分離的[6]， IFNα1/158Val蛋白氨基酸序列114位則為丙氨酸殘基(GCG)、158位為纈氨酸殘基(GTG)，其基因由我國學(xué)者黎孟楓等人于1991年從中國漢族人胎肝染色體中克隆的[4]。 同樣，IFNα2基因也僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)等位基因，分別為IFNα2a、IFNα2b和IFNα2c,其編碼基因也僅有137和170核苷酸位點(diǎn)存在差異。IFNα2a基因是1980年由美國學(xué)者Goeddel在急性髓系白血病細(xì)胞系(KG-1)cDNA中克隆的[7]，IFNα2b基因是1980年由美國學(xué)者Streuli從健康白種人外周血白細(xì)胞中克隆的[8]，IFNα2c基因是1985年由美國學(xué)者Bodo從Namalwa類淋巴母細(xì)胞系中克隆的[9]。成熟的IFNα2a蛋白特征是23位氨基酸殘基為賴氨酸(AAA)、34位為組氨酸殘基(CAT)，IFNα2b蛋白在23位為精氨酸(AGA)、34位為組氨酸(CAT),IFNα2c蛋白在23位(AGA)和34位(CGT)均為精氨酸殘基。

早在20世紀(jì)90年代，就有關(guān)于人干擾素α2等位基因變異體在人基因組DNA中組成的研究。Lee等人[10]調(diào)查了干擾素α2等位基因變異體在北美大規(guī)模人群中的分布情況，發(fā)現(xiàn)超過99.9%人群含有IFNα2b基因，不超過0.04%的小比例人群擁有IFNα2c基因，IFNα2a基因沒有在正常人群中檢測出來。Kita等人[11]檢測了103例健康日本人基因組DNA中IFNα2等位基因的組成，結(jié)果顯示103例健康日本人體內(nèi)只檢測出IFNα2b基因，沒有檢測出IFNα2a和IFNα2c基因。然而，尚沒有干擾素α1等位基因在正常人群中分布情況和干擾素α2等位基因在中國漢族人群中分布情況的研究報(bào)道。鑒于此，本研究通過測定100例中國漢族志愿者外周血基因組干擾素α1和干擾素α2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列的方法，旨在探明干擾素α1和干擾素α2等位基因在中國健康漢族人群基因組DNA中的分布情況。

1 材料和方法

1.1 血樣采集

招募100例健康中國漢族自愿獻(xiàn)血者，其中女41人，男59人，最小年齡21周歲，最大年齡50周歲，平均年齡 29.9(±5.8)周歲。100例自愿獻(xiàn)血者來自全國20個(gè)省、直轄市和自治區(qū)。所有自愿獻(xiàn)血者均符合以下要求：1)父母雙方均為漢族；2)性別、年齡不限； 3)無乙肝、丙肝等傳染疾病史；4)近6個(gè)月內(nèi)檢查無腫瘤和血液疾病；5)排除孕婦、哺乳期女性。采集每名志愿者外周血2～4 mL于5 mL醫(yī)用抗凝血采集管內(nèi),放置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 提取外周血基因組DNA

從-20 ℃冰箱取出志愿者抗凝血血液樣本，在50 ℃水浴鍋中加熱融解。取2 mL血液樣本與4 mL裂解液混合[10%蔗糖,5 mmol/L氯化鎂,5 mL Tris-HCl(pH 8.0),1.0% Triton ×100]，離心收集細(xì)胞核后加入2.2 mL細(xì)胞核裂解液[0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA (pH 8.0),0.15 mol/L NaCl，1% SDS溶液]和80 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，50 ℃水浴3 h。加入等體積5 mol/L乙酸銨離心去除蛋白，上清液加入等體積的異丙醇沉淀全血基因組DNA，然后溶于100 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液中，測定DNA濃度后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖中顯示是IFNα1基因189個(gè)密碼子(包括信號(hào)肽和成熟IFNα1蛋白)和57個(gè)bp的3′端非編碼區(qū)核苷酸片段，大寫字母部分表示編碼區(qū)核苷酸序列，小寫字母部分表示3′端非編碼區(qū)核苷酸序列。下劃線部分表示引物IA1-P1和IA1-P2對(duì)應(yīng)的核苷酸序列位置。陰影字母表示3個(gè)干擾素α1等位基因在410和541位點(diǎn)上的核苷酸序列差異， IFNαD：Val114(GTG),Leu158(TTG);IFNα1：Ala114(GCG),Leu158(TTG); IFNα1/158Val：Ala114(GCG),Val158(GTG)

圖1干擾素α1基因核苷酸序列

Figure 1 The nucleotide sequence of interferon alpha 1 gene

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

PCR引物使用Primer Premier 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。干擾素α1基因片段擴(kuò)增PCR引物序列為：IA1-P1：5′-GATGGTCCTGGTGGTGCT-3′；IA1-P2: 5′-AAGCGTGACCTGGTGTATGA-3′。IA1-P2引物為長度20 bp的3′端非編碼區(qū)核苷酸序列互補(bǔ)片段，引物IA1-P1和IA1-P2位置以及其擴(kuò)增干擾素α1基因片段序列見圖1。引物IA1-P1和IA1-P2可以擴(kuò)增出長度為601 bp片段，包含干擾素α1基因后面181個(gè)密碼子和3′端57個(gè)非編碼區(qū)核苷酸，待檢測的干擾素α1基因的410和541位點(diǎn)核苷酸位于該基因片段內(nèi)。

干擾素α2基因片段擴(kuò)增PCR引物序列為：IA2-P1：5′-AGGTTTAGGCTCACCCATTTC-3′；IA2-P2:5′-ACAGGCTTCCAGGTCATTCA-3′。IA2-P2引物為長度20 bp的編碼區(qū)互補(bǔ)序列，引物IA2-P1和IA2-P2位置以及其擴(kuò)增干擾素α2基因片段序列見圖2。引物IA2-P1和IA2-P2可以擴(kuò)增出長度為415 bp片段，包含IFNα2基因前121個(gè)密碼子和52個(gè)bp的5′端非編碼區(qū)核苷酸，待檢測的干擾素α2基因137和170位點(diǎn)核苷酸位于該片段內(nèi)。

圖中顯示是IFNα2b基因前121個(gè)密碼子(包括信號(hào)肽)和52個(gè)5′端非編碼區(qū)核苷酸片段，大寫字母部分表示編碼區(qū)核苷酸序列，小寫字母部分表示5′端非編碼區(qū)核苷酸序列。下劃線部分表示IA2-P1和IA2-P2對(duì)應(yīng)的核苷酸序列位置。陰影字母表示3個(gè)干擾素α2等位基因在137和170位點(diǎn)上存在的核苷酸序列差異， IFNα2a：Lys23(AAA),His34(CAT);IFNα2b：Arg23(AGA), His34(CAT); IFNα2c：Arg23(AGA), Arg23(CGT)

圖2IFNα2b基因部分核苷酸序列

Figure 2 The nucleotide sequence of interferon alpha 2b gene

1.4 PCR擴(kuò)增

取100 ng全基因組DNA放置于PCR反應(yīng)混合物中，PCR反應(yīng)混合物包括10 μL 2×PremixTaqTM(TaKaRa),1 μL上游引物IA1-P1或IA2-P1，1 μL下游引物IA1-P2或IA2-P2，并加dddH2O至總反應(yīng)體積為20 μL，10 μL礦物油覆蓋PCR反應(yīng)混合物以防止水分的蒸發(fā)。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)采用美國BIO-RAD伯樂T100 PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)程序設(shè)置如下:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸反應(yīng)7 min后，于4 ℃下保存。反應(yīng)完成后取5 μL反應(yīng)液在1.5%含溴乙錠的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，以評(píng)估PCR擴(kuò)增的效果。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序

采用全自動(dòng)DNA測序儀對(duì)擴(kuò)增出的干擾素α1和干擾素α2基因DNA片段進(jìn)行核苷酸序列測定。對(duì)IA1-P1、IA1-P2擴(kuò)增的干擾素α1基因片段使用IA1-P1引物進(jìn)行單端測序，對(duì)IA2-P1、IA2-P2擴(kuò)增的干擾素α2基因片段使用IA2-P1引物進(jìn)行單端測序。核苷酸序列測定具體操作方法為：1)PCR產(chǎn)物模板DNA的處理。向PCR原液中加入Exonuclease I和蝦堿性磷酸酶，放入PCR儀中37 ℃孵育10 min，然后80 ℃變性2 min。2)測序擴(kuò)增。使用BigDye? Terminator v3.1測序試劑盒，按照試劑盒要求配制測序反應(yīng)體系，包括8 μL BigDyeTMTerminator 3.1 Ready反應(yīng)混合物、2 μL(約300 ng)引物IA1-P1或IA2-P1、2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物模板DNA和6 μL dddH2O,反應(yīng)總體積為20 μL，再加入10 μL礦物油覆蓋反應(yīng)液相。測序擴(kuò)增反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min；反應(yīng)后于4 ℃下保存。3)測序反應(yīng)產(chǎn)物純化。按照BigDyeTM V3.1測序試劑盒的使用操作手冊(cè)進(jìn)行，采用乙醇/醋酸鈉的方法純化，純化后的測序產(chǎn)物放置于室溫下晾干。4)上樣和電泳。在純化后的測序反應(yīng)產(chǎn)物DNA中加入Hi—Di去離子甲酰胺10 μL，在PCR儀上95 ℃變性 4 min，然后迅速置于冰上冷卻4 min。使用美國ABI 3730xl DNA基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，收集數(shù)據(jù)并用chromas軟件分析測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳顯示，以人外周血基因組DNA為模板，采用IA1-P1、IA1-P2引物對(duì)和IA2-P1、IA2-P2引物對(duì)可以明顯擴(kuò)增出一條特定的基因片段，根據(jù)DNA分子量Marker判斷，IA1-P1、IA1-P2引物對(duì)擴(kuò)增片段長度約為600 bp, IA2-P1、IA2-P2引物對(duì)擴(kuò)增DNA片段長度介于400～500 bp，兩者均與設(shè)計(jì)長度相一致，基本可以判定為干擾素α1和干擾素α2基因DNA片段，如圖3所示。

泳道1、2、3為IA2-P1、IA2-P2引物對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，分別以1、13、22號(hào)志愿者外周血基因組DNA為模板；泳道4、5、6為IA1-P1、IA1-P2引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，分別以4、6、29號(hào)志愿者外周血基因組DNA為模板；DNA Marker片段長度從上至下相應(yīng)為100、200、300、400、500、600 bp

圖3IA1-P1、IA1-P2引物對(duì)和IA2-P1、IA2-P2引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳情況
Figure 3 Electrophoresis maps of the amplified products of primers(IA1-P1，IA1-P2)and primers (IA2-P1，IA2-P2)

2.2 干擾素α1基因序列分析

使用IA1-P1引物對(duì)擴(kuò)增的干擾素α1基因DNA片段進(jìn)行單端測序，可以清晰測出長度約為600 bp的核苷酸序列，測序結(jié)果均能分析出干擾素α1基因中+410和+541位點(diǎn)核苷酸的堿基類型，如圖4所示。100例中國健康人群基因組DNA中僅檢測出IFNα1基因，沒有檢測出IFNαD和IFNα1/158Val兩種干擾素α1基因變異體。所有樣本的干擾素α1基因的+410位點(diǎn)堿基均為胞嘧啶(C)，+541位點(diǎn)堿基均為胸腺嘧啶(T)。除了待檢測兩個(gè)核苷酸位點(diǎn)外，其他所有的核苷酸序列均與NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫中公布的IFNα1基因完全一致。

100例中國健康漢族人的IFNα1基因+410位點(diǎn)均為胞嘧啶(C)，+541位點(diǎn)均為胸腺嘧啶(T)，對(duì)應(yīng)密碼子分別為GCG(Ala114)和TTG(Leu158)

圖4IFNα1基因+410位點(diǎn)和+541位點(diǎn)核苷酸序列分析圖譜
Figure 4 The nucleotide sequencing map of IFN alpha1 gene at the sites of +410 and +541

2.3 干擾素α2基因序列分析

使用IA2-P1引物對(duì)擴(kuò)增的干擾素α2基因DNA片段進(jìn)行單端測序，可以清晰測出長度約為400 bp的核苷酸序列，測序結(jié)果均能分析出干擾素α2基因中+137和+170位點(diǎn)核苷酸位點(diǎn)的堿基類型，如圖5所示。同樣，100例中國健康人群基因組DNA中僅檢測出IFNα2b基因，且所有樣本的核苷酸序列均與NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫中公布的IFNα2b基因序列完全一致，沒有發(fā)現(xiàn)其他核苷酸位點(diǎn)的突變。

100例中國健康漢族人的干擾素α2基因+137位點(diǎn)均為鳥嘌呤(G)，+170位點(diǎn)均為腺嘌呤(A)，對(duì)應(yīng)密碼子分別為AGA(Lys23)和CAT(His34)

圖5干擾素α2基因+137位點(diǎn)和+170位點(diǎn)核苷酸序列分析圖譜
Figure 5 The nucleotide sequencing map of IFN alpha2 gene at the sites of +137 and +170

3 討論

為了測定干擾素α1和干擾素α2等位基因在中國漢族人群中的分布，我們抽取了100例健康中國漢族人外周血白細(xì)胞基因組DNA，采用PCR方法分別擴(kuò)增了長度為601 bp的干擾素α1基因片段和長度為415 bp的干擾素α2基因片段，兩種干擾素α基因的擴(kuò)增片段均包含待測的核苷酸位點(diǎn)。由于所有13種α干擾素基因均沒有內(nèi)含子且相互之間具有50%以上氨基酸序列的同源性[12]，特別是干擾素α1和干擾素α13基因蛋白編碼區(qū)氨基酸序列完全相同[13]，為了僅獲得我們所需要的特異干擾素α1和α2基因片段，而不是其他的α干擾素基因片段，兩對(duì)基因擴(kuò)增引物均包括了編碼區(qū)和非編碼區(qū)核苷酸序列。這些序列均根據(jù)NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫公布的人類基因組序列獲得的，我們首先確定干擾素α1基因編碼序列位于(chr9:21 440 508-21 441 077)和干擾素α2基因編碼序列位于(chr9:21 384 763-21 385 329)區(qū)域，然后分別查獲兩個(gè)基因5′和3′端非編碼區(qū)長度為100 bp的核苷酸序列，再采用引物設(shè)計(jì)軟件獲得設(shè)計(jì)的引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)我們獲得了想要的DNA片段，為大范圍的人群干擾素α1和干擾素α2基因測序提供了保證。

本研究結(jié)果表明，IFNα1基因在中國漢族人群中屬于干擾素α1的優(yōu)勢等位基因，且沒有發(fā)現(xiàn)IFNα1基因其他核苷酸位點(diǎn)的突變。這與Manry等人[14]報(bào)道IFNα1基因在186例健康撒哈拉以南非洲、歐洲和亞洲健康人中的非同義或無義突變比例高達(dá)94.6%的內(nèi)容不符，有待于以后的研究來進(jìn)一步確認(rèn)。從結(jié)構(gòu)上看，IFNα1擁有166個(gè)氨基酸殘基，含有5個(gè)半胱氨酸(Cys)，其中1和99位Cys之間形成二硫鍵，29和139位Cys形成二硫鍵，86位上是第5個(gè)Cys。從生物學(xué)活性上看，IFNα1在老鼠細(xì)胞上抗病毒活性較高[15-16]，但在人體細(xì)胞上的抗病毒活性在所有13個(gè)IFNα亞型中是最低的[17]。目前，在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索不到IFNα1b的基因序列，因此，關(guān)于IFNα1b基因的來源問題目前有3種說法。第一種說法認(rèn)為IFNα1b是我國學(xué)者將美國Goeddel等人發(fā)現(xiàn)的IFNα1進(jìn)行重命名[4]；第二種說法認(rèn)為IFNα1b是中國學(xué)者從中國人臍帶血白細(xì)胞中克隆的新基因[18]；第三種說法認(rèn)為IFNα1b是IFNα1的變異體，因?yàn)樵谏a(chǎn)過程中86位上的Cys會(huì)干擾IFNα1蛋白的復(fù)性，導(dǎo)致出現(xiàn)較多的異構(gòu)體蛋白，我國學(xué)者將其突變?yōu)樘於彼?Asp)，并構(gòu)建了相應(yīng)的IFNα1b表達(dá)菌株[19]。

另外，在100例中國漢族人群中僅檢測出IFNα2b基因,沒有檢測出IFNα2a和IFNα2c基因，也沒有發(fā)現(xiàn)IFNα2b基因其他核苷酸位點(diǎn)的突變。本研究結(jié)果與Manry等人[14]報(bào)道結(jié)果相一致，在186例健康撒哈拉以南非洲、歐洲和亞洲健康人中干擾素α2基因非同義或無義突變比例僅為1.08%；同時(shí)與Lee等[10]和Kita等[11]研究結(jié)果相一致，Lee等人報(bào)道在28 000個(gè)北美人群中IFNα2b屬于優(yōu)勢等位基因，其中16例中國人僅檢出IFNα2b基因；Kita等人報(bào)道103例健康日本人僅檢測出IFNα2b基因，IFNα2c基因僅在白血病患者中比例較高。本次研究結(jié)果和以上文獻(xiàn)均支持IFNα2b序列是中國漢族人和現(xiàn)代智人的優(yōu)勢等位基因。另外，有研究顯示[20]10 700個(gè)健康人白細(xì)胞經(jīng)病毒誘導(dǎo)后主要分泌IFNα2b。Manry等[14]認(rèn)為IFNα2b基因在苛刻的自然選擇下的突變阻斷預(yù)示著其在抗病毒和預(yù)防癌癥等生理功能方面是必不可少的。從蛋白結(jié)構(gòu)上看，成熟的IFNα2b含有165個(gè)氨基酸殘基，而其他人類干擾素α蛋白均擁有166個(gè)氨基酸殘基，從序列分析其缺少了44位上的天冬氨酸殘基[3]。IFNα2b特有的蛋白結(jié)構(gòu)在人類細(xì)胞培養(yǎng)上表現(xiàn)出非常高的抗病毒活性[17]，但在小鼠細(xì)胞上的活性卻較低，并不能保護(hù)小鼠細(xì)胞免受病毒的感染[15-16]。與干擾素α1基因在整個(gè)有胎盤哺乳動(dòng)物廣泛存在不同， 干擾素α2屬于靈長類哺乳動(dòng)物特有的干擾素基因[21]，而IFNα2b則可能屬于人類特有的干擾素亞型。

早在20世紀(jì)90年代，國外研究已經(jīng)證實(shí)注射重組人干擾素α2b(rhIFNα2b)治療后患者血清中α干擾素的中和抗體和結(jié)合抗體發(fā)生率顯著低于rhIFNα2a。Von Wussow等[22]報(bào)道rhIFNα2a在慢性粒細(xì)胞白血病患者中的抗體產(chǎn)生率顯著高于rhIFNα2b，且其誘導(dǎo)的血清抗體滴度也很高。Antonelli等[23]在慢性乙型肝炎患者中以及學(xué)者Oberg[24]在實(shí)體瘤患者中均證實(shí)注射rhIFNα2a的抗體產(chǎn)生率顯著高于rhIFNα2b。由此表明，在臨床使用中，與人群基因型不匹配的rhIFNα2a的免疫原性較高，而與人體基因型匹配的rhIFNα2b免疫原性較低，更適合人體內(nèi)注射使用。本次研究基本明確了中國漢族人群中干擾素α1和α2基因多樣性的遺傳背景信息，有助于臨床對(duì)重組人干擾素α的正確選擇，有助于提升重組人干擾素α的臨床治療效果。

本次研究結(jié)果顯示：在中國健康人群中僅檢測出IFNα1和IFNα2b基因，沒有檢測出IFNαD和IFNα1/158Val兩種干擾素α1基因變異體，也沒有檢出IFNα2a和IFNα2c兩種干擾素α2基因變異體。盡管IFNα1的基因序列與中國漢族人遺傳背景匹配，但是其在人體細(xì)胞中的抗病毒較低；而IFNα2b是人類特有的高活性干擾素和人類白細(xì)胞分泌的主要干擾素亞型，屬于中國漢族人的基因，更適合中國人使用。