騰沖嗜熱厭氧桿菌ahpC編碼基因的克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析

鄭航輝, 高 昇, 楊宇澤, 吳 潤(rùn), 萬(wàn)學(xué)瑞, 王 川, 劉 磊

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070； 2. 北京市畜牧總站， 北京 100101)

騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4是1998年我國(guó)科學(xué)家從云南騰沖縣的熱泉里分離出的一株嗜熱厭氧菌株，在50 ℃到80 ℃之間生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度是75 ℃[1]，同時(shí)也是我國(guó)第一個(gè)完成全基因組測(cè)序和基因注釋的原核微生物[2]。為什么嗜熱菌可以在相對(duì)苛刻的條件下生長(zhǎng)和繁殖？研究者從不同的角度對(duì)嗜熱菌的嗜熱機(jī)制進(jìn)行了廣泛而深入的探究，所涉及的方面包括嗜熱菌的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性以適應(yīng)高溫[3-5]、蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)對(duì)高溫的適應(yīng)[6-9]、酶的結(jié)構(gòu)和功能及金屬離子的保護(hù)作用等[10]。此外，截至2017年超過(guò)80株嗜熱微生物的全基因組序列被發(fā)布，通過(guò)比較嗜熱菌和常溫細(xì)菌的生物學(xué)信息，分析嗜熱機(jī)制也是一個(gè)研究方向，包括基因組的GC含量[11]；氨基酸的組成和使用頻率[12-13]等。雖然嗜熱菌單一因素的嗜熱機(jī)制被廣泛研究，但由于細(xì)菌的生命活動(dòng)在很大程度上是一個(gè)很復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，因此對(duì)嗜熱微生物嗜熱機(jī)制進(jìn)行更廣泛和深入地分析不僅有助于我們對(duì)原始地球環(huán)境的理解以及生物進(jìn)化機(jī)制的研究，而且還能促進(jìn)一些耐熱蛋白、耐熱酶等活性物質(zhì)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。

AhpC是一種硫氧還原蛋白依賴的烷基過(guò)氧化氫還原酶，能夠還原有毒的氫化氧化物[14]。AhpC是細(xì)菌清除自由基的一種主要成分，如果烷基過(guò)氧化氫還原酶基因功能缺陷就會(huì)導(dǎo)致包括形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面性質(zhì)在內(nèi)的表型改變[15]。AhpC可以催化減少過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物，參與到冷壓力或熱壓力反應(yīng)過(guò)程中[16]。依據(jù)測(cè)序完成的基因組數(shù)據(jù)和已發(fā)現(xiàn)AhpC家族的其他生物學(xué)信息，騰沖嗜熱厭氧菌基因tte0270被注釋為ahpC的一種。我們通過(guò)使用騰沖嗜熱厭氧基因組作為模板克隆ahpC并體外表達(dá)AhpC，希望使用生物信息學(xué)手段來(lái)分析AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱性中發(fā)揮的作用，希望為日后研究騰沖嗜熱菌的嗜熱機(jī)制提供重要的信息，為嗜熱機(jī)制的闡明奠定良好的工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-28a，感受態(tài)菌E.ColiBL21 (DE3)和E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏；騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4菌株由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所譚華榮研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

騰沖嗜熱厭氧桿菌培養(yǎng)基(TTE培養(yǎng)基)用于騰沖嗜熱厭氧桿菌培養(yǎng)[17]；2×YT培養(yǎng)基用于重組菌的誘導(dǎo)，LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)的培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

XhoⅠ、RNase Inhibitor、BamHⅠ、DNase I、T4 DNA Ligase購(gòu)自大連寶生物工程公司； IPTG、卡那霉素、FastPfu fly DNAPolymerase均購(gòu)自TransGen Biotech有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶Super Script Ⅲ購(gòu)自Invitrogen；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；鎳離子親和柱購(gòu)自GE公司；超純RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司。其他試劑購(gòu)自國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中騰沖嗜熱菌MB4(AE008691.1)ahpC在GenBank中的序列設(shè)計(jì)引物，并送金唯智科技有限公司合成。引物序列如下：ahpC-F:5′-CGCGGATCCATGGAGGAAATTAG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；ahpC-R:5′-CCGCTCGAGTTTCAAAGGTTTGTGTACG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.2 騰沖嗜熱厭氧桿菌基因組DNA的提取

在TTE培養(yǎng)基中75 ℃培養(yǎng)騰沖嗜熱厭氧桿菌，使用試劑盒提取嗜熱菌基因組DNA。

1.2.3ahpC基因的擴(kuò)增

以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性35 s，50.7 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)。將ahpC和pET-28a雙酶切，16 ℃連接，將其轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取質(zhì)粒，雙酶切判定，測(cè)序正確后，將其定名為pET-28a::ahpC。

1.2.4 AhpC蛋白的表達(dá)及純化

將pET-28a::ahpC轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21(DE3)中，表達(dá)及純化方法參照文獻(xiàn)[18]。為分析AhpC蛋白表達(dá)情況，以誘導(dǎo)前、后的菌液作為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 RNA提取及實(shí)時(shí)定量RT-PCR

ahpC上游引物：5′-CGACTGAAAGCCCAATGAGT-3′，下游引物5′-GCAGGAAAATGGTTTGTGCT-3′；16sRNA上游引物：5′-CGTAGGCGGTTTAGCAAGTC-3′，下游引物：5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′。

分別在50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃培養(yǎng)厭氧桿菌。RNA提取及RT-PCR方法參照文獻(xiàn)[17]。以16s RNA作為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)了50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃下騰沖嗜熱菌ahpCRNA的表達(dá)量變化。反應(yīng)結(jié)束后對(duì) Ct 值采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。分別對(duì)每個(gè)溫度的 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用 SPSS 軟件進(jìn)行 ANOVA單因素方差分析，P<0.05，表示有顯著性差異。

1.2.6ahpC序列的生物信息學(xué)分析

選擇騰沖嗜熱厭氧桿菌(AE008691.1)、嗜冷菌單核細(xì)胞增生李斯特菌(NC_017537.1)、常溫菌大腸桿菌(NC_000913.3)的ahpC基因序列，使用在線軟件Prot-Param分析騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌基因序列編碼氨基酸序列組成及其理化性質(zhì)[30]；使用在線軟件 ProtScale分析3種AhpC蛋白疏水性；使用在線軟件 TMHMM v.2.0預(yù)測(cè)騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白跨膜區(qū)；使用在線軟件 PORTER來(lái)預(yù)測(cè)騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用程序SignalP 3.0 Server分析騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白信號(hào)肽；使用在線軟件SWISS-MODEL/ SWISS-PdbView等，按照同源建模法構(gòu)建出騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌菌株AhpC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ahpC的PCR擴(kuò)增結(jié)果及pET-28a::ahpC重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

經(jīng)PCR擴(kuò)增出的ahpC片段與已知的目的基因片段長(zhǎng)度相符(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明ahpC大小為663 bp。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 5000；1：pET-28a::ahpC雙酶切；2：pET-28a質(zhì)粒雙酶切；3：ahpC基因PCR產(chǎn)物

M:DL 5000 DNA Marker; 1：Double endonuclease digestion product of pET-28a::ahpC; 2:Double endonuclease digestion product of pET-28a; 3：PCR products ofahpC

圖1ahpC的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pET-28a::ahpC重組質(zhì)粒雙酶切

Figure 1 Electrophoresis of PCR products of objective gene and pET-28a::ahpCrecombinant plasmid digested

2.2 AhpC蛋白的純化

通過(guò)SDS-PAGE 發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后菌體沉淀出現(xiàn)特異性條帶，而誘導(dǎo)前菌體沉淀無(wú)特異條帶，純化后在25～35 ku之間出現(xiàn)單一條帶，AhpC蛋白大小符合預(yù)期(圖2)。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3：純化后的 pET28a-AhpC表達(dá)蛋白；4：誘導(dǎo)后的pET28a-AhpC菌液；5:未誘導(dǎo)的pET28a-AhpC菌液

M：Protein molecular weight Marker；1，2，3：Purification recombinant expressed protein pET-28a::ahpC；4：pET-28a::ahpCinduced with IPTG ；5：pET-28a::ahpCnot induced with IPTG

圖2AhpC表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the AhpC expressed product

2.3 ahpC在不同溫度下的轉(zhuǎn)錄分析

將50 ℃的表達(dá)量定義為1，結(jié)果顯示：在60 ℃、75 ℃和80 ℃表達(dá)量是相對(duì)于50 ℃表達(dá)量的3.9倍、13.6倍和26.5倍(圖3)。明顯看出隨著溫度的升高ahpC表達(dá)量增高，ahpC的表達(dá)與溫度呈正相關(guān)。

16S RNA作為內(nèi)參基因，50 ℃時(shí)ahpC表達(dá)量作為1

16SrRNA was used as internal control, and the transcription at 50 ℃ was arbitrarily assigned as relative 1

圖3ahpC在50℃、60℃、75℃和80℃下的轉(zhuǎn)錄分析

Figure 3 Relative transcriptional level ofahpCunder 50 ℃, 60 ℃, 75 ℃ and 80 ℃

2.4 騰沖嗜熱菌ahpC及AhpC的生物信息學(xué)分子特征

2.4.1ahpC序列及AhpC氨基酸序列的分子特征

通過(guò)在線程序EXPASY分析得到騰沖嗜熱菌ahpC基因全長(zhǎng)663 bp,其中A堿基146個(gè)(22.0%)、T堿基243個(gè)(36.7%)、G堿基125個(gè)(18.9%)、C堿基149個(gè)(22.5%)，AhpC編碼220個(gè)氨基酸，AhpC分子質(zhì)量約為26 ku，等電點(diǎn)(pI)為6.126，分子式為C1158H1795N299O323S7。通過(guò)生物信息學(xué)分析比較了ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：騰沖嗜熱菌AhpC中脯氨酸含量比大腸桿菌高1.3%，比李氏桿菌高1.3%；騰沖嗜熱菌AhpC中Arg和Lys含量分別為4.1%和8.6%，大腸桿菌為3.2%和7.5%，李氏桿菌為2.7%和4.8%；騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%。騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC中Leu含量為7.3%，Ile為6.8%，大腸桿菌和李氏桿菌中均為7.0%和5.9%。騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%(表1)。

2.4.2ahpC編碼蛋白質(zhì)的疏水性分析

疏水性對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成和穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用，在線程序ProtScale對(duì)AhpC的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，蛋白疏水性平均值為-0.272，最大值為1.700，最小值為-2.311,不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為31.99，脂肪系數(shù)為89.00，表明為親水蛋白。潛在疏水區(qū)分別位于16～17、34～42、45～47、49～53、69～79、81～82、95～105、111～112、124～140、142、153～160、166～167、181～184、186～188位aa。其中疏水性最強(qiáng)的是位于第95～105位的氨基酸。

表1 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)

2.4.3 AhpC跨膜區(qū)、信號(hào)肽位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，也不存在信號(hào)肽位點(diǎn)。

2.4.4 AhpC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和AhpC三級(jí)結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)

應(yīng)用Predict Protein 工具分析顯示：利用在線程序PORTER軟件預(yù)測(cè)AhpC的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，有64個(gè)(19.1%)氨基酸殘基參與形成α-螺旋，有99個(gè)(45%)氨基酸殘基組成無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)，有57個(gè)(25.9%)氨基酸殘基參與構(gòu)成β-折疊。同時(shí)對(duì)AhpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌、李氏桿菌中編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸殘基進(jìn)行比較結(jié)果如表2所示。使用在線軟件 SWISS-MODEL/SWISS-PdbView 等，根據(jù)同源建模法預(yù)測(cè)出ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖5所示，騰沖嗜熱菌的AhpC的三級(jí)結(jié)構(gòu)比其他兩種菌株更緊湊。

H：α-螺旋；C：無(wú)規(guī)卷曲；E：β-折疊

H：Α-helix；C：Random coil；E：β-extension

圖4騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
Figure 4 Prediction of secondary structure of AhpC ofThermoanaerobactertengcongensis

3 討論

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是研究嗜熱微生物嗜熱機(jī)制的熱點(diǎn)和關(guān)鍵。通過(guò)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高ahpCmRNA表達(dá)量顯著升高，Liu等人[19]發(fā)現(xiàn)敲除ahpC會(huì)導(dǎo)致騰沖嗜熱厭氧桿菌死亡，我們推測(cè)ahpC編碼蛋白在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱過(guò)程中起到重要作用。

表2 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

A、B和C分別代表AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌中編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

A, B and C were the representative of AhpC in the three level structure prediction of the coding protein ofThermoanaerobactertengcongensis,EscherichiacoliandListeriamonocytogenes

圖5AhpC三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Figure 5 Prediction of tertiary structure of AhpC

使用生物信息學(xué)分析ahpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和李氏桿菌中編碼蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株在CG含量、氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有明顯差異。蛋白質(zhì)中各種氨基酸殘基的含量和分布會(huì)對(duì)極端嗜熱蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)氨基酸側(cè)鏈對(duì)蛋白質(zhì)的嗜熱性質(zhì)可能起決定性作用[20]。脯氨酸(Pro)具有最低的構(gòu)象熵[21]；半胱氨酸(Cys)在高溫條件下易發(fā)生氧化作用；堿性氨基酸賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)均參與離子鍵的形成，并且在高溫條件下精氨酸所參與形成的離子鍵熱穩(wěn)定性更強(qiáng)[22]。將騰沖嗜熱菌的AhpC與來(lái)自常溫菌的大腸桿菌和來(lái)自嗜冷菌的李氏桿菌的AhpC氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，騰沖嗜熱菌AhpC中Pro、Arg含量高于大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量，而Lus、Cys含量比大腸桿菌和李氏桿菌低。蛋白質(zhì)的疏水性在促進(jìn)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性中也起到了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)的側(cè)鏈?zhǔn)杷宰顝?qiáng)，而較大的疏水作用可以使肽鏈折疊成更加緊密的結(jié)構(gòu)，這有利于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[23]，而騰沖嗜熱菌AhpC中Leu和Ile 含量高于在大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量。

騰沖嗜熱菌AhpC不存在跨膜區(qū)域，說(shuō)明該蛋白可能是非表面結(jié)構(gòu)蛋白，也不存在信號(hào)肽，表明AhpC為非分泌蛋白。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)作為一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的樞紐，是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵點(diǎn)，經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)騰沖嗜熱菌AhpC屬于混合型蛋白[24]。較多的α-螺旋氨基酸殘基的存在有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[25]，并且α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成會(huì)使蛋白分子表面 loop結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度縮短，有利于提高蛋白分子的熱穩(wěn)定性[26]，而α-螺旋在騰沖嗜熱菌AhpC中含量高于大腸桿菌和李氏桿菌。對(duì)騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)明顯比另外兩種菌株更緊湊，這有利于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定。

本研究發(fā)現(xiàn)騰沖嗜熱菌ahpC表達(dá)量與溫度呈正相關(guān)，并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析了AhpC蛋白熱穩(wěn)定性高于大腸桿菌和李氏桿菌的AhpC蛋白的原因。騰沖嗜熱厭氧桿菌中AhpC的存在明顯增強(qiáng)了其環(huán)境適應(yīng)性。本研究為未來(lái)騰沖嗜熱菌的嗜熱機(jī)制的闡明提供重要的信息，為嗜熱機(jī)制的研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。