多囊卵巢綜合征患者卵丘顆粒細胞中特異性環(huán)狀RNA的表達研究

馬志，趙慧珊，張妍，劉曉妍，郝翠芳*

(1.青島大學醫(yī)學部，青島 266071；2.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，煙臺 264000；3.中科院動物研究所，北京 100101)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的內分泌疾病，具有較大異質性。根據不同的診斷標準和人群統(tǒng)計，其發(fā)病率介于6%～8%(NIH標準)至20%(鹿特丹標準)之間[1-2]。在無排卵性不孕患者中，約有75%被診斷為PCOS[3]。罹患PCOS的女性會出現(xiàn)全身多個系統(tǒng)的短期和長期并發(fā)癥，包括生殖(多毛、閉經、無排卵、不孕和妊娠合并癥)、代謝(2型糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病和脂質代謝異常)和精神(消極、焦慮)等方面[4]。目前針對PCOS的治療也多為對癥處理，尚無法完全治愈。

環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)現(xiàn)多認為是非編碼RNA的一種，因其呈閉合環(huán)狀結構，缺少5’帽端和3’ poly A尾而得名。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，circRNA普遍存在于多種真核生物中，可抵御RNA酶R的降解，表達呈現(xiàn)出組織和時序特異性[5]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA通過“吸附”microRNA(miRNA)、調節(jié)可變剪接和親本基因表達，廣泛參與到各類疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤、子癇前期，心血管和神經系統(tǒng)疾病[6-9]等方面，但在PCOS中尚未見報道。本研究通過芯片檢測及后續(xù)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證PCOS患者卵丘顆粒細胞中特異性circRNA的表達，并對circRNA表達水平和患者臨床特征資料進行關聯(lián)分析，為進一步探索PCOS發(fā)病機制和診療方法提供了新的思路。

資料與方法

一、研究對象

1.患者來源：收集2017年5～12月期間于青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學科行IVF/ICSI-ET助孕的典型PCOS患者6例，同時選取同時期因男方或者輸卵管因素治療的6例患者為對照組。收集卵丘顆粒細胞，送circRNA芯片檢測；芯片結果回報后，另選取同時期的PCOS及卵巢正常對照各25例患者，收集卵丘顆粒細胞進行qRT-PCR驗證。

入組標準：PCOS組患者均嚴格按照鹿特丹標準[10]篩選：稀發(fā)排卵或無排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素表現(xiàn)或高雄激素血癥，滿足其中兩條及以上，且排除先天性腎上腺皮質增生、庫欣綜合征和雄激素分泌性腫瘤等導致雄激素異常升高的疾病；正常對照組患者均因男方或輸卵管因素而尋求助孕治療。排除標準：子宮內膜異位癥、甲狀腺或內分泌功能異常及全身系統(tǒng)性疾病等情況。所有患者均為第一周期、標準長方案促排卵。

2.主要試劑及儀器：Trizol reagent(Takara，日本)、QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN，德國)、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN，德國)、qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成；NanoDrop 2000分光光度計(ThermoFisher Scientific，美國)、StepOnePlus 實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)、Human CircRNA Array v2芯片檢測平臺(北京博奧)。

二、研究方法

1.資料收集：分別收集PCOS(n=25)及正常對照組患者(n=25)臨床特征資料進行回顧分析。收集內容包括：年齡，體重指數(shù)(BMI)，抗苗勒氏管激素(AMH)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH、雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳素(PRL)、抑制素B(INHB)和25-(OH)D3水平，以及促排卵過程中的Gn總用量、獲卵數(shù)、優(yōu)質胚胎數(shù)和優(yōu)胚率。

2.卵丘顆粒細胞的收集：HCG扳機后36 h，按照取卵標準穿刺取卵，獲得卵母細胞-放射冠-卵丘顆粒細胞復合體(COC)，用1 ml注射器針頭仔細機械剝離得到卵丘顆粒細胞，PBS清洗3遍后，凍存于-80℃待提取RNA。

3.總RNA提取及逆轉錄：依照Takara Trizol regent說明書，采用一步法抽提顆粒細胞總RNA。取1 μl RNA溶液，NanoDrop 2000測定濃度及A260/A280判斷純度。取1 μg總RNA于20 μl體系中，根據QuantiTect Reverse Transcription Kit說明書步驟逆轉錄為cDNA。

4.CircRNA芯片檢測：由北京博奧公司Human CircRNA Array v2芯片平臺完成，包含可檢測170 340種人circRNA的探針。circRNA靶序列來自Circbase、Deepbase和Rybak-Wolf2015[11]等數(shù)據庫。

5.qRT-PCR：circRNA具有特殊環(huán)狀結構，其與同源的mRNA的差異僅在成環(huán)的接頭處，因此所有引物均針對接頭處序列進行擴增。由NCBI的Primer-BLAST設計完成，內參基因選定β-actin，引物序列見表1。將逆轉合成的cDNA稀釋5倍作為模板，按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit說明書操作，具體反應條件如下：95℃預變性2 min，然后按照95℃ 5 s，60℃ 10 s，進行40個循環(huán)；記錄各組Ct值，采用2-ΔΔCt法計算circRNA相對表達量。每個樣本至少3次重復，每次實驗重復3遍。

表1 熒光定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計學處理

結果

一、患者的一般資料及臨床特征

1.circRNA芯片送檢樣本來源患者：PCOS組患者BMI、AMH、LH、LH/FSH、T均顯著高于對照組(P<0.05)；PCOS組獲卵數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；Gn總用量低于對照組，優(yōu)胚數(shù)稍高于對照組，但均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間其他參數(shù)比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

2.進行qRT-PCR驗證患者：PCOS組患者的BMI、AMH、LH、LH/FSH、T和P均顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)SH顯著低于正常對照組(P<0.05)；促排卵過程中PCOS組獲卵數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)，Gn總用量低于對照組、優(yōu)胚數(shù)稍高于對照組，但均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間年齡、優(yōu)胚率、E2、PRL、INHB和25-(OH)D3差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

二、circRNA芯片表達譜

從芯片數(shù)據聚類圖和散點圖(圖1)可以看出，進行芯片檢測的6例PCOS與正常對照患者樣本卵丘顆粒細胞circRNA的表達存在顯著差異。在286個篩選的差異表達circRNA中，PCOS組上調表達167個，下調表達119個。為進一步驗證芯片結果的準確性，我們按差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)>4，P<0.01挑選出3個待測circRNA(表4)，在擴大樣本(PCOS與正常對照各25例)中進行qRT-PCR檢測。

表2 circRNA芯片樣本來源患者的基本臨床資料(-±s)

注：本中心優(yōu)質胚胎指受精第3天，細胞數(shù)在6～9，分級為1或2級的胚胎；優(yōu)胚率=第3天優(yōu)胚數(shù)/2PN胚胎數(shù)；與PCOS組比較，*P<0.05；T、P、PRL換算為法定單位分別為(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

表3 qRT-PCR驗證的兩組患者一般資料與臨床特征(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；T、P、PRL換算為法定單位分別為(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

A：聚類圖；B：散點圖；紅色和綠色分別表示在PCOS組中顯著上調和下調的基因；P和N分別代表PCOS組和對照組樣本

表4 待測circRNA基本信息

三、待測circRNA在兩組患者卵丘顆粒細胞中的表達情況

統(tǒng)計結果顯示，PCOS組中hsa_circ_0043533表達量顯著高于對照組(P<0.05)，hsa_circ_0097636顯著低于對照組(P<0.01)，qRT-PCR結果與芯片結果相一致；而hsa_circ_0020491表達在兩組間無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

四、circRNA表達與PCOS臨床特征值的相關性分析

統(tǒng)計結果顯示，PCOS組hsa_circ_0043533(r=0.399 9，P=0.047 6)和hsa_circ_0097636(r=0.507 5，P=0.009 6)的相對表達量與T水平均呈正相關；正常對照組中hsa_circ_0097636的相對表達量與E2水平有正相關性(r=0.608 8，P=0.005 7)(表5)。

圖2 3個驗證circRNA在PCOS和正常對照組患者中的表達

表5 Spearman秩相關分析患者臨床特征值與差異表達circRNA之間的相關性

注：*P<0.05

五、circRNA對于PCOS的診斷效力

hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636作為診斷指標時，ROC曲線的AUC分別為0.709(95%CI：0.566-0.851)、0.738(95%CI：0.599-0.877)。hsa_circ_0097636聯(lián)合T作為診斷指標，可得出Logistic回歸方程：Logit(P)=-0.206 3+(-2.539× hsa_circ_0097636)+(13.254×T)，AUC為0.893(95%CI：0.807-0.978)，敏感度0.68，特異性為1(圖3)。

圖3 不同差異表達的circRNA診斷PCOS的ROC曲線

討論

PCOS的病因至今尚未完全明確，臨床表現(xiàn)也存在高度異質性，以卵泡發(fā)育障礙和激素合成異常，尤其是雄激素合成亢進為顯著特征。現(xiàn)廣泛認為PCOS是多重遺傳與環(huán)境因素共同作用下導致的復雜病癥[12]。迄今為止，已有包括MAPK-ERK、Wnt/β-catenin和PI3K-Akt pathways[12-14]等在內的多條信號通路在PCOS發(fā)病機制中被提出，這些信號通路包含miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等眾多非編碼RNA分子的參與，為更好地靶向治療PCOS提供了思路。

CircRNA最早于20世紀70年代在高等植物中被首次發(fā)現(xiàn)，但受限于當時的研究手段，其曾一度被認為是轉錄過程的副產物或由錯誤剪接所形成。直到近十年，隨著高通量測序和生物信息學技術的迅猛發(fā)展，人們才認識到circRNA是廣泛穩(wěn)定存在的，且具有相當重要的調節(jié)功能[15]。目前，circRNA在轉錄和轉錄后水平發(fā)揮的多種作用被提出并加以研究[16]，其最為主要的功能是作為miRNA“海綿”：小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as)是circRNA的一種，研究表明其在腦組織中可吸附63個miR-7；在研究斑馬魚中腦的發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，過表達CDR1as會引起miR-7表達下降而導致中腦發(fā)育受損[17]。在大多數(shù)研究中，circRNA會下調其靶向miRNA的表達，進而上調miRNA下游靶向mRNA的表達以調控基因功能網絡。例如，在糖尿病患者視網膜組織中上調circHIPK3會通過“吸附機制”阻斷miR-30a-3p的功能而上調下游VEGF-C、FZD4和WNT2的表達，并最終導致內皮增生和血管功能障礙[18]。但近來也有研究指出與前者截然相反的發(fā)現(xiàn)：利用CRISPR/Cas9技術靶向敲除小鼠基因組中的CDR1as位點會導致實驗動物腦組織中miR-7表達異常、穩(wěn)定性下降，而miR-7下游靶基因Fos和Nr4a3表達顯著升高，出現(xiàn)感知運動功能和神經精神系統(tǒng)障礙[19]。這些研究表明，circRNA在競爭性內源性RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNAs)網絡中的作用遠比想象的要復雜，還需要更加深入的探索。

相對于circRNA，miRNA在PCOS中的研究則要廣泛、成熟許多。如今已有大量具有重要功能的miRNA在PCOS患者外周血、卵泡液和顆粒細胞中被發(fā)現(xiàn)：miR-93在PCOS患者脂肪細胞中顯著高表達，可通過靶向結合葡萄糖轉運體4(Glucose transporter isoform 4，GLUT-4)的3′UTR區(qū)下調GLUT-4的表達而導致胰島素抵抗癥狀的出現(xiàn)[20]；miR-320a在PCOS患者卵丘顆粒細胞中顯著低表達，可引起編碼激素合成關鍵酶的基因Cyp17a1和Cyp19a1的調節(jié)障礙，而出現(xiàn)顆粒細胞的雌激素合成缺陷[21]。

鑒于眾多學者對于circRNA作為“miRNA海綿”這一特殊功能的報道，本研究通過芯片平臺檢測及后續(xù)qRT-PCR的挑選驗證，首次揭示了PCOS患者卵丘顆粒細胞中特異性circRNA的表達。證實hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636在PCOS患者卵丘顆粒細胞中分別顯著上調和下調。相關性分析提示，二者的表達與患者睪酮水平呈現(xiàn)正相關性。眾所周知，高雄激素血癥是PCOS誘發(fā)因素和顯著特征之一，但有研究指出雄激素受體敲除的小鼠會出現(xiàn)嚴重的生殖缺陷，這也提示了雄激素在平衡卵泡發(fā)育與卵泡閉鎖之間的重要作用[22]。本研究中，我們通過miRanda (34.236.212.39/microrna/home.do)和Targetscan (www.targetscan.org/vert_71/)對circRNA和miRNA的相互作用進行了預測。在眾多預測結合的miRNA中，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b和miR-30c有hsa_circ_0097636結合位點，miR-132有hsa_circ_0043533結合位點，而這3種miRNA在之前關于PCOS的研究中均有報道[22-24]。miR-125b為抗凋亡miRNA的一種，在卵巢組織中表達豐富[25]，過高的雄激素可促進miR-125b的表達，進而避免卵泡的凋亡和閉鎖[22]，這或許能部分解釋伴有高雄激血癥的PCOS患者易出現(xiàn)過多卵泡發(fā)育。已有報道m(xù)iR-30c在PCOS患者血清中高表達[23]，我們推測上調表達的miR-125b和miR-30c可能是由于hsa_circ_0097636顯著低表達，導致“吸附”減少所致。另有一項基因組水平的篩選實驗發(fā)現(xiàn)miR-132可抑制體外培養(yǎng)的人卵巢細胞三種甾體激素(P、E2和T)的合成[24]，我們猜測hsa_circ_0043533可能通過“吸附” miR-132來影響PCOS患者卵巢局部的激素合成?？偟膩碚f，本研究驗證的兩種在卵丘顆粒細胞中異常表達的circRNA可能通過特定的circRNA-miRNA相互作用而影響到PCOS患者的卵泡發(fā)育和激素合成。

本研究通過繪制ROC曲線評價了不同差異表達的circRNA對于PCOS的診斷效能，對比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合hsa_circ_0097636與T可使診斷效能顯著提高。由于circRNA可抵抗RNA酶R的降解，具有足夠高的穩(wěn)定性，其有望在未來作為診斷或篩選PCOS的一個良好生物學分子指標。

綜上所述，PCOS患者卵丘顆粒細胞中circRNA hsa_circ_0097636和hsa_circ_0043533的表達水平與正常對照組相比存在顯著差異。本研究證實了兩種差異表達的circRNA與T水平的相關性，初步驗證了聯(lián)合hsa_circ_0097636與T診斷PCOS的可能性。驗證出的兩種circRNA可能通過circRNA-miRNA的相互作用參與卵泡發(fā)育和激素合成的調控過程繼而影響到PCOS的發(fā)生發(fā)展，但此推論尚需更進一步的實驗驗證。本研究為深入理解PCOS發(fā)病機制和探索診治方法提供了更為廣闊的思路。