辛基酚對(duì)萼花臂尾輪蟲毒性效應(yīng)的研究

李若男，王再興，夏洋，吳建新，陸正和

（淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005）

環(huán)境激素對(duì)人類及動(dòng)物健康的影響已日益引起人們關(guān)注[1]。烷基酚聚氧乙烯醚（APEs）為非離子表面活性劑，廣泛應(yīng)用于洗滌用品、塑料、殺蟲劑等方面，隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，其對(duì)水體的污染日趨嚴(yán)重。辛基酚（Octylphenol，簡(jiǎn)稱OP）為APEs的合成原料和主要降解產(chǎn)物，目前在土壤和水體中已有發(fā)現(xiàn)，為雌性激素最強(qiáng)的烷基酚類化合物，能夠干擾動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖造成危害[2]，對(duì)魚類的生殖影響也有報(bào)道[3-5]，但OP對(duì)水生浮游動(dòng)物輪蟲的影響未見(jiàn)報(bào)道。

輪蟲為淡水浮游動(dòng)物的重要組成部分，具有分布廣，繁殖快，生活周期短，易培養(yǎng)，為魚類良好的開(kāi)口餌料。同時(shí)也是水生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的模式動(dòng)物[6]。其中24 h急性毒性和生命表參數(shù)研究為評(píng)價(jià)環(huán)境激素對(duì)輪蟲毒性常用的方法[7-8]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)輪蟲的有性生殖較無(wú)性生殖對(duì)環(huán)境激素敏感，因此利用輪蟲的生殖評(píng)估環(huán)境激素效應(yīng)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[9]。鑒于目前水體中OP污染有加劇趨勢(shì)，該文以萼花臂尾輪蟲為受試動(dòng)物，研究OP對(duì)輪蟲主要生殖影響為利用評(píng)價(jià)OP潛在危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來(lái)源和培養(yǎng)

萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus，簡(jiǎn)稱輪蟲）采自淮海工學(xué)院校園池塘，挑選單個(gè)孤雌生殖雌體，馴化培養(yǎng)2個(gè)月后，大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)其種群產(chǎn)生休眠卵，以后試驗(yàn)所用的輪蟲為休眠卵孵化而來(lái)，孵化使用EPA培養(yǎng)液（96 mg NaHCO3，60 mg CaSO4，60 mg MgSO4和 4 mg KCl，1 L 去離子水），溫度（25±1）℃，光強(qiáng) 200 lx，L∶D=12∶12，時(shí)間 24 h，輪蟲餌料為蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），該藻使用HB-4培養(yǎng)液培養(yǎng)，達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期后收集離心，EPA稀釋成所需濃度投喂[10]。

1.2 OP對(duì)輪蟲急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)用 OP（4-tert-octylphenol，分析純 99.0%，Sigma-Aldrich公司），先用丙酮將這種酚類物質(zhì)配成100.0 mg/L母液，然后用EPA將母液稀釋到所需試驗(yàn)濃度，1周用完。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，配制OP濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6和 3.2 mg/L，以上濃度中丙酮濃度不超過(guò)（0.2%）另設(shè)丙酮（0.2%）對(duì)照組和空白對(duì)照組。挑選剛孵出的輪蟲幼體20只，放入到容有2 mL測(cè)試液的培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在（25±1）℃，無(wú)光的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，24 h后解剖鏡下觀察并記錄每孔中輪蟲死亡數(shù)，對(duì)死亡數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件中Probit法計(jì)算OP對(duì)輪蟲24 h的半致死濃度LC50。

1.3 OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段和產(chǎn)卵量影響

根據(jù)LC50值，配制 OP濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08和 0.16 mg/L（分別約為 LC50的 1/90、1/45、2/45、4/45、8/45），另設(shè)丙酮（0.2%）對(duì)照組和空白對(duì)照組。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，取剛孵出的輪蟲幼體（＜2 h）1個(gè)接入容有1 mL以上測(cè)試液（內(nèi)含0.5×106cells/mL小球藻）的細(xì)胞培養(yǎng)板中，為防藻類和輪蟲沉底，每6 h懸浮試管底部藻液，試驗(yàn)開(kāi)始的48 h，每隔3～4 h觀察1次，記錄輪蟲首次產(chǎn)卵及產(chǎn)幼時(shí)間，最后1次產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)幼時(shí)間并記錄輪蟲產(chǎn)卵數(shù)，及時(shí)移去新生的幼體，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，各測(cè)試組重復(fù)5次，試驗(yàn)至全部個(gè)體死亡為止[11]。

1.4 OP對(duì)輪蟲2 d的r和7 d休眠卵產(chǎn)卵影響

取剛孵出的輪蟲幼體6個(gè)，接入到含有12 mL以上測(cè)試液的14 mL的試管中（內(nèi)含3.0×106ells/mL小球藻），每6 h懸浮試管底部藻液，2 d后將試管中輪蟲倒入培養(yǎng)皿中統(tǒng)計(jì)輪蟲數(shù)量，統(tǒng)計(jì)后將所有輪蟲全部移入原來(lái)試管中繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)輪蟲休眠卵的數(shù)量，休眠卵數(shù)量包括攜有性雌體所攜的休眠卵，試驗(yàn)設(shè)丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)在溫度（25±1）℃，黑暗中進(jìn)行[12-13]。

1.5 相關(guān)參數(shù)的定義和分析方法

各主要發(fā)育階段：胚胎發(fā)育期（指從卵產(chǎn)出到幼體孵出所經(jīng)歷的時(shí)間）；繁殖期（幼體孵出到產(chǎn)第1枚卵所經(jīng)歷時(shí)間）；繁殖期（指從第1枚卵產(chǎn)出到最后1枚卵產(chǎn)出經(jīng)歷時(shí)間）。

平均壽命（繁殖前期、繁殖期、繁殖后期之和）；r：種群增長(zhǎng)率（population growth rate）：r=(lnNt-lnN0)/t，Nt和N0分別為試驗(yàn)經(jīng)過(guò)t天和試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的種群數(shù)量，t=2 d；休眠卵產(chǎn)量（resting egg production，RE）：輪蟲在7 d內(nèi)所產(chǎn)的休眠卵數(shù)量。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析（one-way ANOVA），對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異的與對(duì)照組相比進(jìn)行Dunnett's分析，使用sigmaplot 11.0作圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 OP對(duì)輪蟲24 h急性毒性

24 h急性毒性下丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組中輪蟲病死率分別為5.0%與3.75%，經(jīng)t檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05），因此可得出該試驗(yàn)中丙酮添加對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。通過(guò)空白對(duì)照組進(jìn)行LC50計(jì)算，OP濃度對(duì)數(shù)與病死率關(guān)系見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，24 h急性毒性試驗(yàn)中，輪蟲病死率隨著OP 的濃度增加而上升，OP 濃度0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2mg/L下，輪蟲病死率分別為8.75%、23.75%、42.5%、65.0%和92.5%，通過(guò)Probit計(jì)算方程Y=2.14X+0.214，（Y 概率值，X 為濃度對(duì)數(shù)），LC50為 0.91 mg/L，95%置信限為 0.66～1.27 mg/L。

圖1 OP濃度對(duì)數(shù)與病死率關(guān)系

2.2 OP對(duì)輪蟲主要生活階段和產(chǎn)卵量影響

OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段歷時(shí)和產(chǎn)卵量影響見(jiàn)表1。從表1中可以看出，丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組之間對(duì)輪蟲的生殖前期、生殖期、生殖后期、平均壽命及產(chǎn)卵量無(wú)顯著影響（P＞0.05），而OP顯著影響以上指標(biāo)（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，OP濃度在0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖前期、生殖期、生殖后期和平均壽命（P＜0.05），其他濃度無(wú)顯著影響（P＞0.05），OP濃度在0.04 mg/L顯著降低輪蟲的生殖量（P＜0.05），而以上測(cè)試濃度對(duì)輪蟲胚胎發(fā)育無(wú)影響（P＞0.05）。

表1 OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段歷時(shí)和產(chǎn)卵量影響

2.3 OP對(duì)輪蟲2 d生殖參數(shù)影響

試驗(yàn)顯示丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照（0 mg/L）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05），但空白對(duì)照組與濃度為0.08和0.16 mg/L輪蟲2 d的r具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＜0.05）。OP對(duì)輪蟲2 d的r影響情況見(jiàn)圖2。對(duì)OP與r值效應(yīng)關(guān)系，從圖2中可以通過(guò)Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope得到很好擬合，得出曲線為Y=0.49+(0.825-0.49)/(1+(x/EC50)-3.82，半效應(yīng)濃度 EC50為0.053 mg/L。

圖2 OP對(duì)輪蟲2 d的r影響

2.4 OP對(duì)萼花臂尾輪蟲7 d的休眠卵影響

OP對(duì)輪蟲7 d的休眠卵影響見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，OP濃度對(duì)輪蟲7 d的休眠卵產(chǎn)量具有顯著影響（P＜0.05），從濃度為 0.01～0.16 mg/L，輪蟲7 d所產(chǎn)休眠卵產(chǎn)量平均分別為 21.4、11.4、12.2、6.8 和4.4個(gè)，而丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組休眠卵產(chǎn)卵分別為 32.6和 30.2個(gè)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05），而其他濃度組所產(chǎn)休眠卵產(chǎn)量與空白對(duì)照組相比呈顯著下降（P＜0.05），對(duì)濃度與休眠卵產(chǎn)量效應(yīng)關(guān)系，利用Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope擬合，得出曲線為Y=3.78+(30.35-3.78)/(1+(x/EC50)-1.22，EC50為 0.014 mg/L。

圖3 OP對(duì)輪蟲7 d的休眠卵影響

3 討論

3.1 OP對(duì)輪蟲的24 h急性毒性

OP為烷基酚類化合物中具有代表性的環(huán)境雌激素，有關(guān)其對(duì)水生動(dòng)物的急性毒性影響已有報(bào)道，如OP對(duì)泥鰍 24的LC50分別為 3.27 mg/L[14]，對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的LC50為0.73 mg/L[15]。該研究顯示OP對(duì)輪蟲24 h的LC50為0.91 mg/L，因此利用輪蟲24 h急性毒性評(píng)價(jià)OP明顯比泥鰍24 h毒性急性敏感，但敏感性低于中國(guó)林蛙。

3.2 OP對(duì)輪蟲主要生活階段和生殖量影響

由于OP對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖具有潛在的毒性作用，因此利用水生動(dòng)物上述指標(biāo)評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。如劉正濤等研究了OP對(duì)大型溞21 d的生殖影響，發(fā)現(xiàn)OP濃度0.08 mg/L能降低大型溞的生殖量降低，增加溞類后代中雄性比例[16]；OP濃度0.45 mg/L能降低日本青鳉卵孵化率，使魚鰾發(fā)育異常[17]；OP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育72 h的半效應(yīng)濃度為0.5 mg/L[18]。

與魚類等動(dòng)物相比，輪蟲具有個(gè)體小，生命周期短，易培養(yǎng)、對(duì)毒物敏感強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此在評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)方面具有一定優(yōu)勢(shì)。該研究結(jié)果顯示，OP濃度0.08、0.16 mg/L雖對(duì)輪蟲胚胎發(fā)育無(wú)影響，但對(duì)個(gè)體的成熟（生殖前期延長(zhǎng)）、生殖生殖期及壽命都具有抑制作用，徐曉平等研究溴氰菊酯對(duì)萼花臂尾輪蟲生殖時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，其推測(cè)生殖前期的延長(zhǎng)可能是導(dǎo)致輪蟲種群增長(zhǎng)下降的主要原因[19]。

OP濃度0.02 mg/L時(shí)顯著延長(zhǎng)輪蟲的生殖期，但濃度0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖期、壽命、生殖量，推測(cè)輪蟲可能在OP低劑量脅迫下對(duì)生殖、壽命與生殖量之間進(jìn)行生態(tài)策略的權(quán)衡，但在高劑量毒性作用下，輪蟲對(duì)以上權(quán)衡指標(biāo)被破壞，使得上述指標(biāo)下降。該研究顯示輪蟲生殖量比生活階段歷時(shí)在評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)具有較高的敏感性，因此，輪蟲生殖量為評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)具有一定優(yōu)勢(shì)。

3.3 OP對(duì)輪蟲2 d的r值影響

魚類的卵黃原蛋白（VTG）常作為評(píng)價(jià)污染物具有環(huán)境雌激素效應(yīng)的標(biāo)記物之一。吳翠琴等[3]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.02 mg/L能夠顯著誘導(dǎo)真鯛幼魚產(chǎn)生VTG，宮向紅等[4]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.01 mg/L能誘導(dǎo)鯉魚幼魚產(chǎn)生VTG，而該濃度對(duì)魚的生存率、性腺指數(shù)沒(méi)有變化。雷忻等[20]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.12 mg/L能夠誘導(dǎo)泥鰍雄魚產(chǎn)生VTG，而該濃度對(duì)泥鰍肝臟的SOD、CAT無(wú)顯著影響，該研究顯示輪蟲暴露在OP濃度0.08 mg/L下2 d的r顯著下降，利用輪蟲2 d的r評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)其敏感性明顯低于真鯛和鯉魚，但高于泥鰍。Snell等也認(rèn)為輪蟲2 d的生活周期測(cè)試評(píng)價(jià)毒物敏感性高于24 h急性毒性LC50值，該研究顯示輪蟲2 d的r的EC50為0.053 mg/L，明顯低于24 h的LC50為0.92 mg/L。

3.4 OP對(duì)輪蟲7 d休眠卵產(chǎn)量影響

輪蟲休眠卵為有性生殖的最終產(chǎn)物，其形成受溫度、鹽度、污染物等因素影響。Preston等[21]研究表明，萼花臂尾輪蟲種群暴露在PCP濃度0.0025 mg/L和Cu2+濃度0.005 mg/L下其4 d休眠卵產(chǎn)量與對(duì)照組相比顯著下降，但上述濃度對(duì)輪蟲病死率、游泳行為、種群增長(zhǎng)、混交率等指標(biāo)卻無(wú)顯著變化。輪蟲種群暴露在二嗪農(nóng)、殺螟硫磷等農(nóng)藥下7 d休眠卵產(chǎn)量也與出現(xiàn)類似現(xiàn)象[22]，對(duì)此Snell等[13]研究認(rèn)為輪蟲休眠卵產(chǎn)量為評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)最敏感的指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示OP濃度0.01 mg/L能顯著降低輪蟲7 d的休眠卵產(chǎn)量，顯示輪蟲7 d休眠卵產(chǎn)量評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)比輪蟲生殖階段指標(biāo)敏感、2 d的r敏感，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該濃度比泥鰍，真鯛誘導(dǎo)VTG所需的OP濃度要低[3]，因此輪蟲休眠卵產(chǎn)量在評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)方面具有操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用較少等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，水體中OP超過(guò)一定濃度會(huì)干擾輪蟲的生殖，最終會(huì)影響輪蟲的種群數(shù)量變化，其種群變化及OP通過(guò)食物鏈傳遞可能會(huì)對(duì)魚類的生長(zhǎng)、發(fā)育及生殖產(chǎn)生影響，因此有必要對(duì)水體中OP進(jìn)行監(jiān)控，防止其對(duì)水體的進(jìn)一步污染。

颶風(fēng)多里安致加拿大貝類養(yǎng)殖業(yè)受災(zāi)

2019年9月8日，大西洋颶風(fēng)多里安（Dorian）橫掃北美，在加拿大沿海地區(qū)制造100 mm強(qiáng)降水，加拿大海洋漁業(yè)局通知，愛(ài)德華王子島、新斯科舍省和新不倫瑞克省的貝類收成要暫停一周以上。

漁業(yè)局稱，食用被污染的貝類可能造成嚴(yán)重的疾病甚至死亡，即便高溫煮熟也不能降解毒素。

新斯科舍水產(chǎn)養(yǎng)殖協(xié)會(huì)主席Tom Smith表示，颶風(fēng)多里安使該地區(qū)多處牡蠣、貽貝、蛤蜊、扇貝和海藻的養(yǎng)殖遭遇損失，尤其是牡蠣養(yǎng)殖業(yè)，受損率達(dá)到了50%以上。2018年，新斯科舍水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)收入超過(guò)1.2億加元。

加拿大媒體CBC報(bào)道，颶風(fēng)過(guò)后幾十家愛(ài)德華王子島貽貝和牡蠣養(yǎng)殖戶的災(zāi)后清理活動(dòng)持續(xù)了一周，目前還無(wú)法估算損失額。該地區(qū)擁有130家貽貝養(yǎng)殖場(chǎng)，年產(chǎn)量18 600 t，占加拿大產(chǎn)量的80%，產(chǎn)值約6 000萬(wàn)加幣；牡蠣養(yǎng)產(chǎn)量約907 184.74 kg，產(chǎn)值200萬(wàn)加元。

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