北京地區(qū)枸杞白粉病病原菌的鑒定

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025) (長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

枸杞(LyciumchinenseMill)為茄科枸杞屬的一種多年生落葉小灌木植物，是我國傳統(tǒng)的中藥材，同時(shí)還是國家衛(wèi)生部公布的可藥食同源的植物品種之一[1]。干燥成熟的枸杞子含類胡蘿卜素、多糖、脂肪酸、黃酮和多酚等多種活性成分，此外還含有18種氨基酸及鐵、磷、鋰等多種微量元素，具有很高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值[2, 3]。因此，枸杞種植產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，特別是我國西北地區(qū)的枸杞種植已形成產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化模式，是該地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)來源產(chǎn)業(yè)。近年來，由于枸杞種植面積的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重。其中枸杞白粉病的發(fā)生非常普遍，病害發(fā)生初期會(huì)在葉片上形成小范圍白色霉斑，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)枸杞植株會(huì)呈現(xiàn)出一片白色，阻礙植株進(jìn)行光合作用及呼吸作用，最終導(dǎo)致植株葉片變黃、脫落甚至整株死亡[4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)枸杞分布廣泛，多分布于公園及野生自然環(huán)境，白粉病危害嚴(yán)重，影響了其觀賞和生態(tài)價(jià)值。為此，筆者通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對侵染北京地區(qū)枸杞白粉病的病原進(jìn)行鑒定，旨在為白粉病的防治和其病原分類鑒定等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枸杞白粉病病原菌樣品于2016年10月與2017年9月分別采自北京香山公園、北京植物園、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)、八達(dá)嶺長城公園等10個(gè)地方。

1.2 病原菌顯微形態(tài)鑒定

采集白粉病癥狀嚴(yán)重的枸杞葉片進(jìn)行病原菌顯微觀察：取感病嚴(yán)重葉片于體視鏡觀察，挑取白粉菌成熟閉囊殼，制備臨時(shí)玻片標(biāo)本，于顯微鏡下觀察閉囊殼形態(tài)，拍照保存。

1.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 總DNA的提取

用液氮研磨感病葉片，加入提前預(yù)熱的2%CTAB 1mL，混勻，65℃加熱30min(間隔搖動(dòng))；4℃、12000r/min離心10min，取上清，加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，4℃、12000r/min離心10min；取上清，加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，4℃、12000r/min離心10min；取上清，加等體積的異丙醇，于-20℃放置1h，4℃、12000r/min離心10min；去上清留沉淀，之后用70%乙醇清洗沉淀2次，采用真空干燥機(jī)干燥3～5min后，溶于適量無菌ddH2O中，-20℃下保存[5]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總DNA的完整性。

1.3.2 ITS區(qū)域序列PCR擴(kuò)增

ITS區(qū)域序列(包含internal transcribed spacer 1、5.8s ribosomal DNA gene和internal transcribed spacer 2全序列以及18s和28s ribosomal DNA gene部分序列)的PCR擴(kuò)增采用專用白粉菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、PM6(5’-GYCRCYCTGTCGCGAG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、PM5(5’-TTGCTTTGGCGGGCCGGG-3’)[6]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL：模板DNA 0.5μL，引物ITS1和ITS4各1μL，2×HiFi Taq Mix 10μL，ddH2O 7.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，54℃退火20s，72℃延伸1min，循環(huán)36次，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg/L EB 10μL染色)進(jìn)行檢測。

1.3.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序

將獲得的目的條帶利用膠回收純化試劑盒(參照TaKaRa DNA Fragment Purification Kit試劑盒說明)純化后構(gòu)建到PMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證后，將獲得的陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 序列分析

將獲得的測序在NCBI上進(jìn)行BLASTn，下載與該序列同源性高的ITS序列，使用Clustal X軟件進(jìn)行全序列匹配，用MEGA 6.1軟件對序列進(jìn)行分析，基于Kimura-2-Para-meter雙參數(shù)模型，采用NJ法(neighborhood-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病病原菌的形態(tài)觀察

白粉菌侵染枸杞后主要會(huì)感染枸杞植株葉片的兩面、葉柄等部位，感染初期會(huì)在葉片上形成圓形菌斑，嚴(yán)重時(shí)葉片甚至整個(gè)植株都布滿白色粉狀物，影響植株進(jìn)行光合作用(見圖1(a)和圖1(b))，侵染后期會(huì)產(chǎn)生許多黑色小粒點(diǎn)，即為病原菌有性世代閉囊殼(見圖1(c))。成熟后閉囊殼為暗褐色，直徑為110.5～168.4μm，附屬絲較多并生于閉囊殼的‘赤道’部位，常相互交織在一起，長度為閉囊殼直徑的0.5～1.8倍，長度為60.4～220.4μm，閉囊殼頂端1～3次二叉或三叉狀分支，第一次分叉接近中部或下部，并在第一次分叉上進(jìn)行第二次分叉，第二次分叉短且疏松，頂端鈍圓或收縮，無色，壁薄。該閉囊殼形態(tài)與穆氏節(jié)絲殼(Arthrocladiellamougeotii(Lév.) Vassilk)有性態(tài)描述基本一致[7]，所以初步鑒定其為穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。

2.2 白粉病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用白粉菌通用引物ITS1和PM6、ITS4和PM5 2對引物去進(jìn)行ITS區(qū)段擴(kuò)增，經(jīng)PCR擴(kuò)增出500～750bp之間的目的片段(見圖2)。通過測序和序列分析，10個(gè)采樣地點(diǎn)的rDNA ITS序列一致，長度為593bp(GenBank登錄號為MG757562.1)，其中，1～30bp為部分18S rDNA序列，31～218bp為ITS1全序列，219～372bp為5.8S rDNA全序列，373～534bp為ITS2全序列，534～593bp為部分28S rDNA序列。將獲得的序列于GenBank中進(jìn)行BLASTn，顯示其ITS序列與GenBank中的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)的ITS序列同源性大于99.8%，而與其他白粉菌ITS序列的同源性小于91.0%。

圖1 枸杞白粉病的發(fā)病癥狀及顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)

在NCBI的GenBank中搜索并下載相關(guān)白粉菌ITS序列，進(jìn)行同源比對分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)。結(jié)果顯示，其與節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼中國菌株(JX546296.1、KP420475.1)、日本菌株(AB022380.1)、韓國菌株(AF455748.1)、土耳其菌株(KX017568.1)、澳大利亞菌株(AF073358.1)聚為一支，自展支持率達(dá)100%，親緣關(guān)系最為接近，但與同族下的白粉菌(高氏白粉菌屬(Golovinomyces)及新白粉菌屬(Neoreysiphe))，如Golovinomycesambrosiae(KX987303.1)、Golovinomycesbiocellatus(FJ874774.1)、Golovinomycesorontii(AB769458.1)、Neoerysiphegaleopsidis(KR261582.1)、Neoerysiphegeranii(KR048092.1)等的ITS序列親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。鑒于節(jié)絲殼屬只含穆氏節(jié)絲殼1個(gè)種，根據(jù)以上結(jié)果，鑒定來自北京地區(qū)的枸杞白粉病病原菌為穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。

M:DL2000；1和2:ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2 枸杞白粉病病原菌ITS的PCR擴(kuò)增電泳圖 圖3 依據(jù)ITS序列構(gòu)建的白粉病病原菌NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

對來自于北京地區(qū)10個(gè)地點(diǎn)的枸杞白粉病病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這10個(gè)地點(diǎn)的白粉菌有性世代閉囊殼與穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)有性世代描述的特點(diǎn)[7]基本一致。由于穆氏節(jié)絲殼是節(jié)絲殼屬下的唯一種，因此初步認(rèn)為北京地區(qū)的枸杞白粉病病原菌為節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)，這與已經(jīng)報(bào)道的來自不同國家，如日本、澳大利亞、中國等地區(qū)的枸杞白粉菌菌株是一致的[8]。ITS序列作為一種遺傳標(biāo)記，具有明顯優(yōu)越性，ITS區(qū)受外界環(huán)境影響小，進(jìn)化速度快，不但具有保守性而且在科、屬、種水平上具有差異性，能夠?yàn)椴≡姆诸愯b定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供重要依據(jù)[9]。通過ITS序列比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等方法進(jìn)一步鑒定北京地區(qū)枸杞白粉病病原菌，結(jié)果顯示其與來自日本、韓國、土耳其等國家的枸杞白粉菌菌株的ITS序列同源性達(dá)99.8%以上，親緣關(guān)系最為接近，在進(jìn)化樹中形成自展支持率為100%的分枝，由此進(jìn)一步確定了該白粉菌為節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。同時(shí)，由系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出節(jié)絲殼屬與同族的高氏白粉菌屬親緣關(guān)系相對較近，而與同族的新白粉菌屬親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)[10]。該研究鑒定了北京地區(qū)枸杞白粉病病原菌，對于枸杞白粉病的防治和探究高氏白粉菌族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系有著重要作用。