高效液相色譜法測定阿德福韋的含量

黃勵堅(jiān)

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶 526040）

阿德福韋酯是一種新型治療乙肝藥物，被人體吸收后能迅速水解為阿德福韋，因此該藥起到抗病毒作用的是阿德福韋，其學(xué)名為9-[2-(膦酰甲氧基)乙基]腺嘌呤；9-[2-(磷酸甲氧基)乙基]腺嘌呤.研究擬建立一種專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單的阿德福韋含量測定方法，為阿德福韋人體代謝動力學(xué)研究提供支持.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1100高效液相色譜分析儀(安捷倫）；色譜柱：Zorbax SB-Aq；PHS-3C pH計(jì)（雷磁）；十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多XSE）；KQ3200型超聲波清洗器(昆山超聲儀器廠有限公司).

1.2 藥品與試劑

阿德福韋對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號101359-201501,含量100%）；乙腈，色譜純；氫氧化鈉，分析純；磷酸，分析純；磷酸二氫銨，分析純；去離子水.

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-Aq(填料粒徑5 μm，規(guī)格4.6 mm×250 mm).

流動相.溶液A：置1.15 g磷酸二氫銨（NH4H2PO4）于1 000 mL去離子水中，混合均勻，用10%磷酸溶液調(diào)pH值至3.50±0.05，混合均勻，經(jīng)0.45 μm尼龍膜過濾并脫氣；溶液B：HPLC級乙腈.按照表1程序洗脫.

柱溫：30 ℃；流速1ml·min-1；進(jìn)樣量10μl；檢測波長260 nm.

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 000 μg·ml-1）：精密稱量25 mg阿德福韋標(biāo)準(zhǔn)品到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉1.0 ml，加5ml去離子水，超聲至完全溶解，用去離子水稀釋至刻度，混勻.

標(biāo)準(zhǔn)品對照溶液（100μg·ml-1）：移液管移取10.0 ml標(biāo)準(zhǔn)品儲備液到100 ml容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，混勻.

樣品供試液（100μg·ml-1）：精密稱量25 mg阿德福韋供試品到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉1.0 ml，加5 ml去離子水，超聲至完全溶解，用去離子水稀釋至刻度，混勻；移液管移取10.0 ml到100 ml容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，混勻.

用去離子水做為空白樣品溶液.

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣對照品溶液、供試品溶液及空白樣品(離子水)溶液進(jìn)行分析，色譜圖見圖1～圖3.在該條件下，樣品分離良好.

圖1 空白溶液高效液相色譜圖

圖2 對照品溶液高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：用不同體積移液管精密量取2.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品儲備液至不同體積容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度溶液（20.0、50.0、100.0、200.0、250.0、400.0μg·ml-1）.按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖.以藥物濃度對峰面積做線性回歸，得回歸方程為：Y=30.739X-14.777,R=1,結(jié)果顯示阿德福韋在20.0～400.0μg·ml-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，加去離子水分別稀釋制成低、中、高質(zhì)量濃度(20.0、50.0、100.0 μg·mL)的對照品溶液，各分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積.結(jié)果RSD分別為0.56%、0.68%、0.89%(n=6),表明儀器精密度良好.

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，加去離子水分別稀釋制成供試液（100μg·ml-1）6份，依次測量，記錄圖譜，外標(biāo)法計(jì)算含量，按照含量計(jì)算RSD=0.27%(n=6),表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好.

中間精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，加去離子水分別稀釋制成供試液（100μg·ml-1）6份，由第二人在另一臺儀器上測量，記錄圖譜，外標(biāo)法計(jì)算含量，加上重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的6個共12個含量值，計(jì)算得到RSD=0.20%(n=12),表明實(shí)驗(yàn)精密度良好.

穩(wěn)定性試驗(yàn)：配置供試液（100μg·ml-1），分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄圖譜，以峰面積計(jì)算RSD=0.31%(n=5),表明室溫下供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

回收率試驗(yàn)：分別精密稱量20、25、30 mg阿德福韋到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉1.0 ml，加5 ml去離子水，超聲至完全溶解，用去離子水稀釋至刻度，混勻.移液管移取10.0 ml到100 ml容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，混勻，形成相當(dāng)于供試液濃度80%、100%、120%的樣品，每個濃度配3份，進(jìn)行液相測量，記錄圖譜，外標(biāo)法計(jì)算每個濃度的回收率、平均回收率、RSD，以及9個樣品回收率RSD，結(jié)果見表2：

表2 阿德福韋回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

建立了HPLC測量阿德福韋含量的方法，考察了方法的線性、精密度、回收率.結(jié)果表明阿德福韋含量在20～400μg·ml-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=1.000,n=6),平均回收率為100.08%，RSD=0.89(n=9).該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，適用于阿德福韋的含量測定與質(zhì)量控制.