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    青蒿琥酯對(duì)大腸桿菌臨床分離株抗生素敏感性的影響研究

    2019-10-14 01:22:02魏思敏汪培嘉田啟明劉明江李金貴
    中國(guó)獸藥雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:肉湯直徑抗菌

    魏思敏,汪培嘉,田啟明,陶 婭,劉明江,李金貴*

    (1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

    抗生素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模生產(chǎn)與使用是醫(yī)學(xué)史上的巨大進(jìn)步,挽救了數(shù)以億計(jì)的病人。除臨床使用外,抗生素還作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè),在預(yù)防和治療動(dòng)物傳染性疾病,促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面發(fā)揮了重要作用。但抗生素的不合理使用,甚至濫用,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷發(fā)展,在各類致病菌及人與動(dòng)物共生菌中都出現(xiàn)了抗生素耐藥性,并由單一耐藥發(fā)展為多重耐藥[1]。多重耐藥菌的增多與新型抗生素研發(fā)進(jìn)展緩慢之間的矛盾日益凸顯,并可能導(dǎo)致無藥可用的“后抗生素時(shí)代”或“耐藥時(shí)代”。因此,亟需尋找不同的途徑來解決耐藥問題[2]。在沒有新抗生素的情況下,對(duì)耐藥菌可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用聯(lián)合兩種或兩種以上抗生素進(jìn)行治療[3]。研究表明,青蒿素的衍生物青蒿琥酯(artesunate,ARS)除了具有抗瘧作用外,對(duì)于臨床常見的致病菌如大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等感染的治療均有一定效果[4-5],且可增強(qiáng)大腸桿菌和銅綠假單胞菌對(duì)頭孢類抗生素的敏感性[6-7]。但目前ARS與抗生素聯(lián)合抑菌的研究還比較有限,本研究擬通過肉湯稀釋法和平皿打孔法檢測(cè)ARS單獨(dú)或聯(lián)合抗生素對(duì)畜禽源臨床分離E.coli耐藥株的體外抑菌效果,以期為ARS的臨床使用提供參考。

    1 材 料

    1.1 主要試劑 ARS購(gòu)自桂林南藥股份有限公司,含量>97%;抗生素購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司,包括阿米卡星(amikacin,AMK)、鏈霉素(streptomycin,STR)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)、粘菌素(colistin,COL)、土霉素(terramycin,TER)和多西環(huán)素(doxycycline,DOX);細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博科技有限公司(青島海博生物技術(shù)有限公司)。

    1.2 試驗(yàn)菌株及菌液制備 臨床分離畜禽源E.coliMC02、AHM5C23、SHPP23-3、AHCH24-1T、SNJ23、SHPP41,由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院王彥紅博士提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coliATCC25922由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    將E.coli復(fù)壯并增菌培養(yǎng)2~3代,挑選單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

    1.3 ARS及抗生素的制備 將60 mg ARS溶于1 mL 5%碳酸氫鈉水溶液中混勻備用。精確稱取抗生素,用各自對(duì)應(yīng)的緩沖液將抗生素配制成濃度為5120 μg/mL的母液備用。

    2 方 法

    2.1 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定 參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)(M100,2017),采用微量肉湯稀釋法測(cè)定大腸桿菌對(duì)ARS以及10種抗生素的敏感性。在96孔板中對(duì)受試藥物進(jìn)行連續(xù)二倍稀釋,并使用鈣離子調(diào)節(jié)的MH肉湯將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli稀釋為1.0×105CFU/mL,隨后將其接種到含有藥物的96孔板中[8]。在37 ℃下孵育16~20 h后讀取結(jié)果。質(zhì)控菌株選用E.coliATCC 25922標(biāo)準(zhǔn)菌株,所有抗生素和培養(yǎng)基均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

    2.2 抗生素與ARS聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用肉湯棋盤稀釋法測(cè)定ARS分別與AMK、STR、CIP、CTX、COL、TER、DOX 7種抗生素聯(lián)合時(shí)的分級(jí)抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)。

    根據(jù)所測(cè)得的每種藥物對(duì)每種菌株的MIC值,將ARS與其他抗生素分別用鈣離子調(diào)節(jié)的無菌MH肉湯在96孔板中倍比稀釋為2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC,隨后將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli稀釋為2.0×105CFU/mL并接種到含有藥物的96孔板中使終體積為200 μL。以無菌MH肉湯作為陰性對(duì)照,不含藥物的稀釋菌液作為陽性對(duì)照,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育16~20 h后讀取結(jié)果,以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為聯(lián)用MIC。通過公式計(jì)算FIC指數(shù),進(jìn)而判斷ARS與其他抗生素聯(lián)用的作用效果。

    FIC指數(shù)= (甲藥聯(lián)用MIC/甲藥單用MIC)+ (乙藥聯(lián)用MIC/乙藥單用MIC),F(xiàn)IC指數(shù)判讀結(jié)果如下:FIC指數(shù)≤0.5時(shí),兩藥為協(xié)同作用;0.54時(shí),兩藥為拮抗作用[9]。

    2.3 ARS對(duì)抗生素抑菌圈直徑影響試驗(yàn)

    2.3.1E.coli預(yù)處理 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli母液分別接種至含有512、256、128 μg/mL ARS的10 mL MH肉湯中,細(xì)菌終濃度為1×105CFU/mL,并設(shè)置不加ARS的空白對(duì)照組,于200 r/min,37 ℃搖床中培養(yǎng)大腸桿菌至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期進(jìn)行抗生素抑菌圈測(cè)定。

    2.3.2 打孔法測(cè)定抑菌圈直徑 將預(yù)處理的各組菌液分別稀釋至5×105CFU/mL后,吸取200 μL滴加到MH 瓊脂平皿中均勻涂布,用直徑為4 mm的無菌打孔器于平皿表面打孔后加入抗生素,根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn),抗生素含量如下:AMK 30 μg,STE 10 μg,CIP 5 μg,CTX 30 μg,COL 10 μg,TER 30 μg,DOX 30 μg。37 ℃ 培養(yǎng)16~18 h后,使用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑大小[10]。

    2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05作為組間差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。每組試驗(yàn)均重復(fù)三次以上。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 抗生素與ARS的MIC ARS與7種抗生素對(duì)6株臨床分離E.coli的MIC結(jié)果見表1。結(jié)果表明,每種受試菌株對(duì)本試驗(yàn)采用的7種抗生素至少兩種耐藥,其中E.coliMC02和E.coliAHM5C23對(duì)5種以上抗生素耐藥。另外,ARS單獨(dú)使用時(shí)5120 μg/mL仍沒有抗菌作用。

    表1 抗生素與ARS對(duì)6株臨床分離E.coli的MICTab 1 MICs (μg/mL)of different antibiotics for 6 clinical E.coli isolates.

    肩標(biāo)“R”表示耐藥。AMK:敏感,MIC ≤ 16 μg/mL 和耐藥 MIC >64 μg/mL;CIP:敏感,MIC ≤1 μg/mL 和耐藥 MIC >4 μg/mL;CTX:敏感,MIC ≤1 μg/ml 和耐藥 MIC >4 μg/mL;COL:敏感,MIC ≤ 2 μg/mL 和耐藥 MIC >4 μg/mL;TER:敏感,MIC ≤4 μg/mL 和耐藥 MIC >16 μg/mL;DOX:敏感,MIC≤ 4 μg/mL 和耐藥 MIC >16 μg/mL;STR尚無MIC解釋標(biāo)準(zhǔn) (CLSI,2017)。
    “R” means resistance.AMK:Susceptible,MIC ≤ 16 μg/mL and resistant MIC >64 μg/mL;CIP:Susceptible,MIC ≤ 1 μg/mL and resistant MIC >4 μg/mL;CTX:Susceptible,MIC ≤ 1 μg/mL and resistant MIC >4 μg/mL;COL:Susceptible,MIC ≤ 2 μg/mL and resistant MIC >6 μg/mL;TER:Susceptible,MIC ≤ 4 μg/mL and resistant MIC >16 μg/mL;DOX:Susceptible,MIC ≤ 4 μg/mL and resistant MIC >16 μg/mL;breakpoints of STR is not defined (CLSI,2017).

    3.2 抗生素與ARS的協(xié)同作用 在測(cè)試六株臨床分離株中,E.coliMC02和E.coliAHM5C23耐藥最為嚴(yán)重,因此,將ARS分別與抗生素聯(lián)合使用,由表2和表3可見,抗生素與ARS聯(lián)用后,MIC值隨ARS濃度增加呈下降趨勢(shì),當(dāng)ARS為512 μg/mL時(shí),7種抗生素分別與ARS聯(lián)用對(duì)E.coliMC02的FIC指數(shù)均小于0.5,表現(xiàn)為協(xié)同作用。對(duì)于E.coliAHM5C23,除STR與ARS聯(lián)用的FIC指數(shù)為0.6,表現(xiàn)為相加作用外,其余6種受試抗生素與ARS聯(lián)用均表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

    表2 抗生素聯(lián)合ARS抗E.coli MC02的作用效果Tab 2 Results of antibiotics in combination with ARS for E.coli MC02.

    表3 ARS聯(lián)合抗生素抗E.coli AHM5C23的作用效果Tab 3 Results of antibiotics in combination with ARS for E.coli AHM5C23

    3.3 ARS增加抗生素對(duì)臨床耐藥E.coli的抑菌圈直徑 對(duì)于耐藥E.coliMC02和E.coliAHM5C23,ARS對(duì)抗生素抑菌圈影響的結(jié)果如圖1所示,濃度為1024 μg/mL的ARS能夠增大STR與COL的抑菌圈直徑;ARS濃度為512 μg/mL時(shí),COL對(duì)E.coliAHM5C23和STR對(duì)E.coliMC02的抑菌圈增加,其余五種抗生素的抑菌圈未有顯著改變。

    圖1 ARS對(duì)抗生素抑菌圈直徑的影響(A.抗生素對(duì)E.coli MC02抑菌圈直徑;B.抗生素對(duì)E.coli AHM5C23抑菌圈直徑;CON:空白對(duì)照組(Control);QC:質(zhì)控(Quality control);*P<0.05 vs control)Fig 1 The Effect of ARS on the diameter of antibiotics inhibition zone(A.The diameter of inhibition zone for E.coli MC02.B.The diameter of inhibition zone for E.coli AHM5C23.CON:Control,QC:Quality control,*P<0.05 vs control)

    4 討論與結(jié)論

    抗生素被譽(yù)為“20世紀(jì)醫(yī)藥領(lǐng)域最偉大成就之一”,但由于其廣泛、持續(xù)甚至不當(dāng)使用,細(xì)菌耐藥問題越來越嚴(yán)重[11],已被列為將會(huì)對(duì)世界經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響的五項(xiàng)潛在因素之一[12]。在耐藥菌中,致病性E.coli作為對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害最大的細(xì)菌之一,其耐藥問題一直是研究的熱點(diǎn)。由耐藥菌株引起的感染性疾病來勢(shì)兇猛,常規(guī)抗生素很難抑制耐藥菌株的生長(zhǎng),其發(fā)病率增高、治療難度大、致死率高,嚴(yán)重影響人類的生存與健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[13]。但新型抗菌藥物的研發(fā)困難重重,因此,越來越多的研究學(xué)者開始把重點(diǎn)投向耐藥菌株本身,包括如何提高其對(duì)抗菌藥物的敏感性、如何逆轉(zhuǎn)其耐藥性等方面。中藥含有多種有效的抗菌成分,中藥及其復(fù)方的抗菌作用過程是多環(huán)節(jié)、多目標(biāo)、多靶點(diǎn)的復(fù)雜作用過程[14]。目前,鮮有中藥耐藥菌的報(bào)道,這讓中藥逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用研究引起大家的注意,也成為研究的熱點(diǎn)之一。在本試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)ARS能增加多種抗生素對(duì)耐藥大腸桿菌的敏感性,具有顯著的協(xié)同效應(yīng),ARS是一種半合成的青蒿素衍生物,除了具有顯著的抗瘧作用外,還被發(fā)現(xiàn)其他藥理活性,如抗寄生原蟲、抗真菌、抗腫瘤等[15]。然而,關(guān)于ARS的抗菌活性以及聯(lián)合用藥方面的報(bào)道仍不多見。本試驗(yàn)著重于研究ARS單獨(dú)及其與抗生素聯(lián)用時(shí)的體外抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ARS對(duì)六株受試臨床分離株的MIC均大于5120 μg/mL,提示ARS單獨(dú)作用時(shí)不具有抗菌作用,因此,考慮將其與抗生素聯(lián)合,對(duì)受試菌株中多藥耐藥的E.coliMC02和E.coliAHM5C23。進(jìn)行體外聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明ARS與7種抗生素分別聯(lián)用時(shí),抗生素的MIC可以降低2~32倍以上,提示ARS與多種抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用,能夠明顯降低抗生素的用量,或可作為抗菌增效劑使用,對(duì)提高抗生素安全性和延緩耐藥具有重要意義。但目前ARS的增敏機(jī)制仍不明確,需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)全面地揭示其作用,進(jìn)一步明確ARS的增敏機(jī)制及其聯(lián)合抗生素對(duì)耐藥大腸桿菌病的作用效果。Feng等研究發(fā)現(xiàn)20 mg/kg ARS用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型能有效減輕炎癥的發(fā)展,且沒有肝臟毒性[16],由此可以看出,雖然ARS在體外試驗(yàn)中發(fā)揮增敏作用的濃度較抗生素正常用量仍處于較高水平,但在體內(nèi)試驗(yàn)中ARS的使用量符合常規(guī)用量。

    使用聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中ARS的有效濃度512 μg/mL及其2倍用量1024 μg/mL預(yù)處理兩種耐藥E.coli,微量肉湯稀釋法對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn),并未發(fā)現(xiàn)MIC值的改變,因此,采用平皿打孔法觀察抗生素對(duì)ARS預(yù)處理后E.coli抑菌圈直徑的細(xì)微變化,發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后僅能增大STR和COL對(duì)E.coli的抑菌圈直徑,其增敏作用遠(yuǎn)不及ARS與抗生素同時(shí)使用時(shí)的效果。因此,ARS與抗生素同時(shí)使用會(huì)有更好的應(yīng)用價(jià)值,這為ARS或中藥(包括中藥有效成分)在細(xì)菌性疾病領(lǐng)域的研究和臨床實(shí)踐提供了參考。

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