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    甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌對喹紅霉素敏感性分析及其分子分型特點

    2019-10-14 02:40:22胥志超王紅燕潘偉光李桂秋徐廣健余治健鄧啟文李多云
    中國感染控制雜志 2019年9期
    關鍵詞:大環(huán)內(nèi)酯紅霉素類藥物

    黃 震, 胥志超, 張 波, 王紅燕, 陳 重, 白 冰, 潘偉光, 李桂秋, 徐廣健, 余治健, 鄧啟文, 李多云

    (1. 深圳大學醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院感染科及內(nèi)源性感染診治研究重點實驗室,廣東 深圳 518052; 2. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院肺科門診,廣東 深圳 518101; 3. 深圳市醫(yī)院感染質(zhì)量控制中心,廣東 深圳 518052)

    金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus,SA)是引起醫(yī)院及社區(qū)感染的主要病原菌,可引起局部化膿感染,也可引起肺炎、心包炎和腦膜炎,甚至敗血癥、膿毒血癥等全身感染[1-2]。目前的研究大多關注的是耐甲氧西林金黃色葡萄球(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA),然而,有相當一部分的感染是由甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus, MSSA)引起。在我國,MSSA 感染約占SA感染的40%,SA血流感染近一半由MSSA引起[3],國外有研究[4-5]也發(fā)現(xiàn), MSSA引起的血流感染正在增多或至少處于穩(wěn)定狀態(tài)。有報道[6]認為MSSA 攜帶的毒力因子編碼基因如殺白細胞素、溶血素、中毒性休克毒素以及葡萄球菌腸毒素等的比例要明顯高于MRSA。隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床上廣泛使用,SA對大環(huán)內(nèi)脂類-林可酰胺-鏈陽菌素B(macrolide-lincosamide-streptogramin B, MLSB)等耐藥日益嚴重。為解決細菌耐藥問題,SA對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的機制不斷被闡明,第三代大環(huán)內(nèi)酯類藥物酮內(nèi)酯類被開發(fā)出來。喹紅霉素(ABT-773)作為第二個開發(fā)的酮內(nèi)酯類藥物,被認為療效并不差于克拉霉素及泰利霉素。其抗菌機制主要為與23S rRNA上A2058位點及Ⅱ區(qū)A752及Ⅴ區(qū)U2609位點結合,阻止細菌肽鏈的延伸[7-8]。目前,在國內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)喹紅霉素用于抗SA的相關研究報道,而且,大多數(shù)的分子分型研究側重于 MRSA,對于MSSA的分子流行特征所知有限。故本研究旨在了解臨床分離的MSSA對喹紅霉素體外敏感性,并與經(jīng)典大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素相比較,以探討新型大環(huán)內(nèi)酯類藥物對MSSA抗菌效果的進展,進一步探討MSSA不同多位點序列分型(MLST)的型別與喹紅霉素對MSSA最低抑菌濃度(MIC)值之間的關系。

    1 材料與方法

    1.1 菌株來源 118株MSSA分離自深圳市南山醫(yī)院2011—2015年住院患者送檢的各種臨床標本,標本來源為痰38株(32.2%),咽拭子26株(22.0%),其他呼吸道分泌物16株(13.6%), 血15株(12.7%),穿刺液10株(8.5%)、膿液9株(7.6%)和傷口分泌物4株(3.4%)。其中,呼吸道來源共80株(67.8%)??剖襾碓礊镮CU 19株(16.1%)、急診觀察室15株(12.7%)、呼吸科14株(11.9%)、兒科及新生兒科14株(11.9%)及其他科室56株(47.5%)。

    1.2 菌株鑒定與藥敏試驗 所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)鑒定為MSSA,采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法及K-B紙片法進一步測定所有藥物MIC值,主要藥物包括紅霉素、喹紅霉素、利福平、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、阿米卡星、萬古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因和替考拉寧,藥敏紙片、藥物和專用瓊脂由英國OXOID公司提供,質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。喹紅霉素折點參考2016年CLSI M100-S26 標準推薦泰利霉素對SA的折點:敏感(≤1 μg/mL),中介(2 μg/mL),耐藥(≥4 μg/mL)。耐藥率=(中介株數(shù)+耐藥株數(shù))/檢測株數(shù)×100%。

    1.3 基因組DNA提取與純化 采用四段劃線方法分離MSSA, 選取單克隆菌株,經(jīng)液體培養(yǎng)基增菌后離心,采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒按照革蘭陽性菌操作流程提取細菌基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 MLST 采用PCR的方法分別擴增MSSA菌株的7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL),其引物、反應體系及反應條件參照MLST網(wǎng)站(http://Saureus.mlst.net/misc/info.asp),目的基因402~516 bp,PCR產(chǎn)物純化后進行測序,測序結果提交MLST網(wǎng)站(http://mlst.net)比對,與數(shù)據(jù)庫中的SA相應基因的等位基因進行比較,獲得每個管家基因的序號,然后按順序依次排列,最終確定MSSA臨床分離株的ST型。

    1.5 統(tǒng)計學分析 應用軟件SAS 9.4對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,耐藥率的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法,P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 MSSA的耐藥情況 118 株MSSA對喹紅霉素MIC值跨度從≤0.03 μg/mL到>16 μg/mL,中介2株,耐藥21株,耐藥率達19.5%,對紅霉素中介1株,耐藥70株,耐藥率高達60.2%,喹紅霉素及紅霉素對MSSA的MIC值分布見圖1。通過Fisher確切概率法比較前二者MIC值分布,喹紅霉素對MSSA效果均優(yōu)于紅霉素(P<0.001)。MSSA對利福平、環(huán)丙沙星及阿米卡星耐藥率分別為3.4%、3.4%和1.7%;對利奈唑胺、萬古霉素、呋喃妥因、替考拉寧及阿莫西林/克拉維酸均100%敏感。見表1。

    圖1 喹紅霉素及紅霉素對MSSA的MIC值分布

    表1 臨床分離MSSA菌株對常用抗菌藥物的藥敏情況

    S:敏感;I:中介;R:耐藥;MIC:最低抑菌濃度;MIC50/MIC90:分別為抑制50%和90%細菌生長時的最低藥物濃度

    2.2 MSSA的MLST與喹紅霉素MIC值的關系 118株MSSA分為32個ST型,20株菌屬于MLST數(shù)據(jù)庫中未記載的新ST型(NT)。所有ST分型中無特別明顯的優(yōu)勢菌株,數(shù)量位于前三的ST型分別為:ST7型15株(12.7%), ST188型12株(10.2%),ST59型12株(10.2%)。12株ST188型MSSA對喹紅霉素均敏感,其余各不同ST型MSSA對喹紅霉素MIC值分布見表2。

    表2 喹紅霉素對各ST型MSSA的MIC值分布

    NT:新ST型; MIC:最低抑菌濃度;MIC50/90:分別為抑制50%和90%細菌生長時的最低藥物濃度

    3 討論

    SA是最常見的臨床分離革蘭陽性致病菌之一[2, 9],該院SA主要來源于呼吸道標本,其次是血標本,科室集中在ICU和急診觀察室。由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物同時對革蘭陽性球菌和支原體、衣原體等病原體有廣譜抗菌活性,故在臨床上被廣泛用于治療呼吸道感染,但隨之而來的是SA對MLSB耐藥率持續(xù)上升。在本研究中,MSSA對常用的抗SA藥物如阿莫西林/克拉維酸、呋喃妥因、萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧均100%敏感。對利福平、環(huán)丙沙星及阿米卡星亦高度敏感,僅少數(shù)菌株耐藥。該院MSSA對紅霉素耐藥率達60.2%,稍高于徐修禮等[10]于2008年開展的大規(guī)模調(diào)查研究結果。本研究MSSA對喹紅霉素耐藥率為19.5%,MSSA對喹紅霉素及紅霉素的MIC值主要分布在≤0.25 μg/mL及>16 μg/mL組,呈兩端分布,但喹紅霉素對MSSA體外敏感性強于紅霉素(P<0.001)。在國外相關研究[11]中,170株USA300克隆MRSA對喹紅霉素均敏感,也反映了喹紅霉素對SA的強效殺菌效果。SA對MLSB耐藥主要是由于攜帶了甲基化酶基因erm及質(zhì)粒介導的外排泵基因msr等[12],但酮內(nèi)酯類藥物較MLSB類藥物作用位點更多,并且SA的外排泵不能對喹紅霉素進行排出[13],從而可部分對抗MLSB類藥物SA耐藥問題。

    經(jīng)MLST發(fā)現(xiàn),該院MSSA分為32個ST型,ST分型中并無特別明顯的優(yōu)勢菌株,與Liu等[6]調(diào)查結果一致,主要的ST型分別為:ST7、ST188、ST59和ST398,說明臨床分離的MSSA具有高度遺傳多樣性。在其他MSSA 流行病學研究報道中,主要流行型別因研究對象和地域的差異而呈現(xiàn)出差異性,其中 ST398、ST5、ST88、ST25、ST7和 ST188 等是中國較常見的流行型別[14-15],而這些ST型別在該院均有發(fā)現(xiàn)。而SA的分子型別與其耐藥表型有一定的相關性,如ST398、ST7、ST5、ST59等是主要的MSSA多重耐藥克隆[16-17],在本研究中,此4種型別對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率亦較高。ST188、ST30、ST72、ST88、ST1及ST15對喹紅霉素均敏感,但由于其他型別樣本量均較小,故不具代表性。喹紅霉素對其余MLST型MSSA的MIC值分布無明顯特點。

    SA的耐藥機制復雜,故本研究仍存在不足與局限性。首先,本研究未對更多的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行體外敏感性對比研究;其次,本研究未對MSSA中erm基因及msr基因分布進行進一步調(diào)查,MSSA對喹紅霉素耐藥機制有待進一步研究。再次,本研究樣本量較小,對MSSA的種群進化進行研究需要多中心、長期的動態(tài)監(jiān)測,才能為MSSA的防控提供更準確的參考依據(jù)。

    綜上所述,ST7、ST188、ST59和ST398是該院臨床分離MSSA的主要MLST型別。我國MSSA菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥形勢嚴峻,對SA的抗菌效果屬于大環(huán)內(nèi)酯類的“短板”,喹紅霉素與常用于抗SA的其他抗菌藥物相比并無明顯優(yōu)勢,但較經(jīng)典大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素效果已有顯著提升,故筆者相信,隨著新一代大環(huán)內(nèi)酯類藥物的不斷開發(fā),終將能夠達到理想的效果。本研究提示,ST型別與MSSA對喹紅霉素MIC值分布之間無明顯特點,但由于樣本量較小,不一定具有代表性,有待更大樣本量的研究進一步探討。

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