2個(gè)山西地方豬種MX2基因組織表達(dá)譜分析

孫奴奴 白慧慧

摘要：MX2是由干擾素分泌的一個(gè)MX亞型的蛋白，該蛋白具有廣泛的抗病毒作用以及GTP酶活性。本次實(shí)驗(yàn)采用3頭晉汾白豬和3頭新山西黑豬的皮膚、肌肉、脾臟、支氣管淋巴結(jié)等18種組織的總RNA，通過(guò)RT-PCR方法對(duì)MX2基因在晉汾白豬與新山西黑豬的不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。然后通過(guò)SPSS 19軟件對(duì)晉汾白豬與新山西黑豬的肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟、白細(xì)胞與支氣管淋巴結(jié)這四種免疫組織中MX2基因進(jìn)行方差比較及多重檢測(cè)分析。結(jié)果顯示：晉汾白豬的脾與支氣管淋巴結(jié)間的表達(dá)呈顯著差異（0.01

關(guān)鍵詞：豬;MX2基因;RT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S828 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-9737（2019）09-0005-04

Abstract：MX2 is a MX subunit protein secreted by interferon， which has a wide range of antiviral effects and GTP enzyme activity. In this experiment， the total RNA of skin， muscle， spleen and lymph nodes from 3 Jinfen white pigs and 3 new Shanxi black pigs were used. The expression of MX2 gene in different tissues of Jinfen white pig and new Shanxi black pig was detected by RT-PCR. The macrophage， spleen， leukocyte and lymph node of Jinfen white pig and new Shanxi black pig were further analyzed by IBM SPSS Statistics 19 software. The results showed that the expression of MX2 gene was significant different between the spleen of Jinfen white pig and lymph nodes （0.01

Key words：The pig; MX2 gene; RT-PCR

晉汾白豬集合了馬身豬、太湖豬、長(zhǎng)白、大白豬等優(yōu)良品種的優(yōu)異基因，形成的新品種不僅能滿足豬生產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需求，同時(shí)還保持了國(guó)內(nèi)優(yōu)秀豬種、繁殖力強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點(diǎn)[1]，新山西黑豬擁有烏黑的毛色，適應(yīng)環(huán)境能力好，抵抗病毒性能強(qiáng)，生產(chǎn)幼崽多、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)良特點(diǎn)[2]。

MX2蛋白是MX蛋白的一個(gè)亞型，是由干擾素分泌的蛋白，艾滋病病毒的復(fù)制能被MX2基因抑制[3]。MX2蛋白具有很強(qiáng)的抗病毒能力，由于許多動(dòng)物傳染性疾病的發(fā)病機(jī)制受單基因或者多基因的控制，所以許多動(dòng)物對(duì)一些傳染性的疾病存在部分或完全抗性[4]。MX2基因?qū)?xì)胞系中表達(dá)有抑制作用，因此，不在細(xì)胞系中的病毒可以連續(xù)不斷的復(fù)制和擴(kuò)散[5]。位于細(xì)胞系中的病毒由于MX2基因會(huì)充分表達(dá)，病毒則喪失了復(fù)制的能力，新病毒不會(huì)再產(chǎn)生[6]。由此可推出MX2基因具有廣譜的抗病毒功效，可以使多種類(lèi)型的RNA病毒有抑制作用?；罨说腗X2基因可以對(duì)水解病毒核衣殼起到重要的作用，目的是為了阻止病毒吸附與穿入細(xì)胞[7]。已經(jīng)有一些科學(xué)研究證明，MX2在體外對(duì)VSV有明顯的抑制作用。此外，MX2抑制VSV和其他慢性病毒，包括小鼠白血病病毒。之前，有報(bào)道稱(chēng)MX2基因是減少M(fèi)X2KA而不是GTP-binding突變K131A GTP-hydrolysis或者突變T151A。根據(jù)這一現(xiàn)象，有研究表明，MX2基因限制不減少M(fèi)X2KA，但在MX2 K127A和T147A，分別對(duì)應(yīng)于MXB K131A和T151A。因此，MX2可能通過(guò)一種不同于MX2的新機(jī)制抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制[8]。當(dāng)豬被攜帶有乙型腦炎病毒的蚊子叮咬后，豬種就會(huì)被感染上乙型腦炎病毒，該病毒首先會(huì)在皮膚表面的上皮細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)和血管的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部增殖，緊接著進(jìn)入血液中隨血液感染，造成局部的病毒血癥狀[9]。有研究表明，MX2基因能抑制JEV Mx-independent途徑感染[10]。

本實(shí)驗(yàn)以晉汾白豬和新山西黑豬的MX2基因?yàn)槔碚摶A(chǔ)，在組織水平上初步探索MX2基因在晉汾白豬與新山西黑豬不同組織氣管中的表達(dá)情況，明確在晉汾白豬與新山西黑豬豬種中的各個(gè)組織氣管中分別表達(dá)的情況，為研究MX2基因在晉汾白豬與新山西黑豬的生物學(xué)功能提供一些基礎(chǔ)材料，同時(shí)也為豬抗病育種的研發(fā)提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集山西省運(yùn)城市鹽湖區(qū)新龍豐畜牧有限公司健康的46日齡新山西黑豬和49日齡的晉汾白豬各3頭。分別采取每頭豬的免疫系統(tǒng)（脾臟、支氣管淋巴結(jié)、白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞），消化系統(tǒng)（胃、盲腸、肝），呼吸系統(tǒng)（肺、支氣管），泌尿系統(tǒng)（腎），神經(jīng)系統(tǒng)（大腦、小腦），生殖系統(tǒng)（子宮、卵巢），心、肌肉、皮膚、脂肪等18種組織，在液氮中速凍并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱進(jìn)行保存，用Trizol法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2?引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的豬ACTB基因的序列（XM-003124280.2），以及豬ACTB基因mRNA的序列和豬MX2基因的序列為引物模板設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下表1。

1.3?RT-PCR

取三頭晉汾白豬與三頭新山西黑豬的每種組織的cDNA各1 μL，混合于1.5 mL的滅菌離心管中，為制備的cDNA池，以混合的cDNA池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;再分別以3頭晉汾白豬與3頭新山西黑豬中的各四種免疫組織（脾、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)）cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

采用10 μL反應(yīng)體系，即cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.2 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Master Mix 5 μL，補(bǔ)ddH2O至總反應(yīng)體系為10 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性：94℃ 5 min，（變性：94℃ 30 s，退活：50℃ 30 s延伸：72℃ 30 s）35個(gè)循環(huán)，后延伸：72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照保存。

2?結(jié)果與分析

2.1?RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

以3頭豬相同組織的cDNA混合的cDNA池為模板，對(duì)MX2和ACTB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。晉汾白豬結(jié)果如圖1、新山西黑豬結(jié)果如圖2所示：

由圖1所示，晉汾白豬MX2基因在各組織中表達(dá)水平不一致。晉汾白豬的MX2基因在心、肝、脾、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)、子宮、胃、卵巢、皮膚、脂肪、大腦、小腦、支氣管、盲腸中有表達(dá)，在肌肉中不表達(dá)。

由圖2可得，新山西黑豬的MX2基因在心、脾 、肺、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、腎、支氣管淋巴結(jié)、胃、肌肉、脂肪、大腦、小腦、支氣管、盲腸中有表達(dá)。MX2基因在肝、子宮、卵巢、皮膚、肌肉中不表達(dá)。

2.2?晉汾白豬差異比較結(jié)果

通過(guò)IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)MX2基因在晉汾白豬的四種免疫器官（脾、白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)）的表達(dá)進(jìn)行方差分析比較及Duncan（D）多重檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2可得，MX2基因在晉汾白豬四種免疫組織（脾臟、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)）間表達(dá)差異顯著（F =3.036，P=0.043<0.05），然后再進(jìn)行方差分析比較及多重檢驗(yàn)得出，晉汾白豬的脾與白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞，白細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)無(wú)顯著差異（P>0.05）;脾與支氣管淋巴結(jié)呈顯著差異（0.01

2.3?新山西黑豬差異比較結(jié)果

通過(guò)IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)MX2基因在新山西黑豬的四種免疫器官（脾、白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)）的表達(dá)進(jìn)行方差分析比較及Duncan（D）多重檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

由表3可得，MX2基因在新山西黑豬四種免疫組織（脾臟、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)）間表達(dá)差異顯著（F=0.362，P=0.032<0.05），然后再進(jìn)行多重檢驗(yàn)分析得出，晉汾白豬的脾與白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞，白細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)無(wú)顯著差異（P>0.05）;脾與支氣管淋巴結(jié)呈顯著差異（0.01

2.4?晉汾白豬和新山西黑豬間差異比較結(jié)果

采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)MX2基因在晉汾白豬和新山西黑豬中的相同免疫組織的表達(dá)進(jìn)行獨(dú)立T檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)圖3結(jié)果顯示，MX2基因在晉汾白豬與新山西黑豬的脾（P=0.1432>0.05）、肺泡巨噬細(xì)胞（P=0.6222>0.05）、白細(xì)胞（P=0.6148>0.05）間表達(dá)無(wú)顯著差異，在支氣管淋巴結(jié)（0.01

3?結(jié)論

比較晉汾白豬與新山西黑豬的表達(dá)情況，MX2基因在不同組織中都有表達(dá)，但表達(dá)情況不同。此外，同一種組織在不同豬種中的表達(dá)有明顯的差異。經(jīng)過(guò)對(duì)兩個(gè)豬種中的肺泡巨噬細(xì)胞，脾臟，支氣管淋巴結(jié)，白細(xì)胞進(jìn)行比較分析得出：晉汾白豬中脾與白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)，白細(xì)胞與支氣管淋巴結(jié)呈極顯著差異（P<0.01）;肺泡巨噬細(xì)胞與白細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)無(wú)顯著差異（P>0.05）。新山西黑豬中支氣管淋巴結(jié)與白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、脾呈極顯著差異（P<0.01）;脾與白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞呈顯著差異（0.010.05）。晉汾白豬與新山西黑豬相同組織間差異比較結(jié)果表明：在脾臟組織間（P>0.05）、肺泡巨噬細(xì)胞（P>0.05）、白細(xì)胞（P>0.05）間表達(dá)差異不顯著，在支氣管淋巴結(jié)（P<0.05）間的表達(dá)差異顯著。

根據(jù)基因在不同組織中的表達(dá)模式推測(cè)，MX2基因在不同組織中的表達(dá)差異可能與豬各組織對(duì)病原的識(shí)別和抵抗能力不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為MX2在免疫方面發(fā)揮作用提供了一些佐證，也為今后晉汾白豬和新山西黑豬的抗病育種提供了新的思路。但是MX2具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，其實(shí)際的作用機(jī)制還需要進(jìn)行更多的研究。

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