液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法測定人血漿中羥尼酮濃度的不確定度評定*

馬林，楊春曉，周嘉黎，吳健鴻，師少軍，劉亞妮

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022；2.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，武漢 430075)

羥尼酮(hydronidone)為吡啶酮類小分子化合物，化學(xué)名為N-(4-羥基苯基)-5- 甲基-2-吡啶酮；由上海睿星基因技術(shù)有限公司研發(fā)的抗肝纖維化一類新藥，目前處于臨床研究階段[1-2]。其衍生物吡非尼酮(pirfenidone)已被國內(nèi)外批準(zhǔn)上市，用于治療特發(fā)性肺纖維化[2-4]。羥尼酮通過有效抑制肝臟中星狀細(xì)胞的增殖，減少膠原合成，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟中過多堆積，遏制肝纖維化進(jìn)程，但并不影響正常細(xì)胞外基質(zhì)的生成。羥尼酮口服給藥后，吸收迅速，0.33～0.63 h達(dá)血藥濃度峰值，并快速在體內(nèi)消除，t1/2為1.72～3.10 h。高脂飲食會延緩其體內(nèi)的吸收速度，并降低其吸收程度[1]。I期臨床研究表明羥尼酮在15～120 mg劑量呈現(xiàn)良好的耐受性和安全性[1]。

本實(shí)驗(yàn)室建立液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)法測定人血漿中羥尼酮的濃度，為其臨床藥動學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。該方法測定結(jié)果的可靠性直接決定羥尼酮臨床藥動學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，并影響其安全性和有效性的評價。不確定度是指對測量結(jié)果正確性的可疑程度，用于表征合理地賦予被測量值的分散性，是目前國際上普遍推薦使用的定量評估檢測結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)[5-7]。通過評估測定方法的不確定度大小，可衡量測定結(jié)果準(zhǔn)確性的可疑程度，客觀評價測定結(jié)果的質(zhì)量[7-8]。為此，有必要對LC-MS/MS法測定人血漿中羥尼酮濃度的不確定度進(jìn)行評定，有助于改進(jìn)檢測步驟并提高檢測質(zhì)量；如實(shí)反映測量的置信度和準(zhǔn)確度，為羥尼酮人血漿藥物濃度測定方法的改進(jìn)提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司，配備DGU-20A3 脫氣機(jī)、LC-20AD 型二元輸液泵、SIL-20AC型自動進(jìn)樣器、CTO-20AC 型柱溫箱)，API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)，Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)，BS110S 型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，VORTEX GENIUS 3型微型旋渦混合儀(德國IKA公司)，Legend Micro 21R 高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Scientific 公司)，Simplicity超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2試藥 羥尼酮對照品(上海睿星基因技術(shù)有限公司提供，批號：20120101，含量：99.1%)，內(nèi)標(biāo)吡非尼酮對照品(上海睿星基因技術(shù)有限公司提供，批號：20120807，含量：100%)，甲醇和醋酸(色譜純，美國Tedia公司)、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，人空白血漿(武漢市血液中心提供)。

2 方法

2.1測定條件 色譜條件：采用Aglient ZORBAX 300 Extend-C18色譜柱 (2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美國Aglient公司)和Security GuardTMC18保護(hù)柱(4 mm×2.0 mm，5 μm，美國Phenomenex公司)；柱溫設(shè)定為40 ℃；以水-乙腈(78：22)為流動相；流速為0.20 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL；進(jìn)樣器溫度設(shè)定為4 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式；離子噴射電壓(IS)：5500 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃；霧化氣(Gas1，N2)：344.75 kPa；輔助氣(Gas2，N2)：344.75 kPa；氣簾氣(CUR，N2)：172.375 kPa；去簇電壓(DP)：84 V(羥尼酮)，80V(吡非尼酮)；碰撞能量(CE)：39 V(羥尼酮)，35 V(吡非尼酮)；定量分析監(jiān)測離子對分別為：羥尼酮 [M+H]+，m/z202.2→92.0，吡非尼酮[M+H]+，m/z186.1→92.1。

2.2工作溶液的配制

2.2.1羥尼酮工作溶液的配制 平行稱取2份羥尼酮對照品10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，再分別用甲醇進(jìn)一步稀釋為10.0 μg·mL-1的儲備液(標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液和質(zhì)控儲備液)。取標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液用流動相依次稀釋配制成含羥尼酮4 000 (C8)，2 000(C7)，1 000 (C6)，500 (C5)，200 (C4)，100 (C3)，40(C2)，20(C1)ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。取質(zhì)控儲備液用流動相依次稀釋配制成含羥尼酮3000 (H)，600 (M)，60 (L)ng·mL-1的質(zhì)控工作溶液。

2.2.2內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制 取吡非尼酮對照品10 mg，精密稱定，用甲醇溶解，配制成1.01 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液。稀釋該儲備液至101.20 ng·mL-1作為內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.3含藥血漿樣品的配制 用移液器(量程2～20 μL)分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下羥尼酮系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液(C1～C8)和低(L)、中(M)、高(H)濃度質(zhì)控工作溶液各20 μL，置2.0 mL離心管中，然后用移液器(量程20～200 μL)分別精密加入空白血漿200 μL，渦旋30 s，混勻，配制成相當(dāng)于羥尼酮濃度為2，4，10，20，50，100，200和400 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品以及濃度為6，60，300 ng·mL-1的低(L)、中(M)、高(H)濃度質(zhì)控樣品。

2.4血漿樣品處理 采用蛋白沉淀法進(jìn)行血漿樣品前處理。精密吸取血漿樣品50 μL，置1.5 mL離心管中，分別精密加入吡非尼酮內(nèi)標(biāo)工作溶液20 μL、流動相5 μL、10%醋酸溶液20 μL，渦旋30 s后，再精密加入甲醇200 μL，渦旋震蕩5 min，于16 000 r·min-1離心10 min，分別精密吸取上清液和純化水各100 μL，置于進(jìn)樣瓶中混勻后，吸取10 μL進(jìn)樣測定。

2.5樣品測定與計(jì)算 將“2.3”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品按“2.4”項(xiàng)方法處理后，在“2.1”項(xiàng)條件下測定羥尼酮與內(nèi)標(biāo)吡非尼酮的響應(yīng)信號峰面積。以羥尼酮與內(nèi)標(biāo)吡非尼酮的峰面積比值(R)對羥尼酮血藥濃度(C)進(jìn)行加權(quán)最小二乘法線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：R=aC+b。則質(zhì)控樣品和待測血漿樣品中羥尼酮濃度的計(jì)算公式為：C=(R-b)/a，其中：C為羥尼酮最終血漿測定濃度，R為羥尼酮與內(nèi)標(biāo)吡非尼酮的峰面積之比，a為擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率，b為截距。

3 結(jié)果

3.1測量不確定度的來源 羥尼酮血漿樣本測定過程中，對測定結(jié)果產(chǎn)生影響的每一個因素都是不確定度的來源，其來源主要包括：①工作溶液和含藥血漿樣品的配制，涉及的影響因素包括：羥尼酮對照品的純度及稱量，量瓶允差，移液管允差，吸量管允差，移液器允差，樣品均勻性，溫度；②血漿樣品的處理；③標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合；④儀器測定；⑤重復(fù)性測定等。

3.2各分量不確定度的評定[5-10]

3.2.1A類不確定度評定 重復(fù)性引入的不確定度采用A類評定程序。按照“2.3”項(xiàng)下方法分別配制2，4，10，20，50，100，200和400 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，并平行配制6，60，300 ng·mL-1質(zhì)控樣品各5份，重復(fù)配制3批，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)行LC-MS/MS測定，將羥尼酮與內(nèi)標(biāo)峰面積比值帶入相應(yīng)分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得質(zhì)控樣品的濃度，結(jié)果見表1。

表1 羥尼酮血漿樣品重復(fù)測定結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算各組濃度的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差：

測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.2.2B類不確定度評定

內(nèi)標(biāo)稱量引入的不確定度對羥尼酮濃度測定結(jié)果的影響很小，可忽略不計(jì)。羥尼酮稱量的質(zhì)量為10.30 mg，則稱量羥尼酮引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

溶液配制過程中用到10 mL量瓶10次、5 mL單標(biāo)移液管5次、5 mL分度吸量管3次，20～200 μL量程移液器1次，其相對不確定度為：

3.2.2.4血漿樣品提取過程和基質(zhì)效應(yīng)引入的不確定度 按“2.4”項(xiàng)下處理低、中、高濃度的質(zhì)控樣本，進(jìn)行LC-MS/MS測定所得峰面積為A1；空白血漿按“2.4”項(xiàng)處理后加入相同濃度的質(zhì)控及內(nèi)標(biāo)工作溶液進(jìn)行測定所得峰面積為A2；流動相同法操作后進(jìn)行測定所得峰面積為A3，則提取回收率=A1/A2×100%，基質(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%，結(jié)果見表2。

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

各組濃度回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

各組濃度基質(zhì)效應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.2.2.5儀器量化不確定度 質(zhì)譜儀為API 4000，定量允差為3%；液相色譜儀為島津液相系統(tǒng)，吸樣允差為1%。按均勻分布，儀器量化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.2.6線性擬和過程引入的不確定度 羥尼酮血漿樣品的濃度根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立對濃度測定的結(jié)果至關(guān)重要。按“2.3”項(xiàng)下方法配制8個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，每個濃度配制3份；以羥尼酮血漿濃度(C)為橫坐標(biāo)，羥尼酮與內(nèi)標(biāo)吡非尼酮的峰面積比值(R=As/Ai)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/C，共擬合3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表1。

經(jīng)計(jì)算，各質(zhì)控濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.3合成不確定度的評定 羥尼酮濃度測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

經(jīng)計(jì)算低、中、高濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：uc，rel，L=0.051，uc，rel，M=0.043，uc，rel，H=0.052

羥尼酮濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.4擴(kuò)展不確定度的評定 采用簡易評定，取k=2，對應(yīng)的置信概率為95%，則低、中、高濃度的擴(kuò)展不確定度分別為：

UL=kuc，L=2×0.31=0.63 ng·mL-1

UM=kuc，M=2×2.73=5.46 ng·mL-1

UH=kuc，H=2×16.70=33.40 ng·mL-1

血漿中羥尼酮各濃度質(zhì)控測定結(jié)果可分別表示為：低濃度(6.13±0.63)ng·mL-1，中濃度(62.79±5.46)ng·mL-1，高濃度(319.07±33.40)ng·mL-1。

4 討論

筆者建立LC-MS/MS法測定人血漿中羥尼酮的濃度，并對方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)(線性、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、等)均滿足測定要求。為了評估測定結(jié)果的可靠性、提高檢測質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)和指南[5-10]，對該方法進(jìn)行不確定度評定。通過對測定過程中不確定度來源的各分量進(jìn)行分析，計(jì)算各來源不確定度分量值評估各分量值的貢獻(xiàn)大小，以期為測定方法的改進(jìn)提供參考和指導(dǎo)。結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)對各質(zhì)控濃度不確定度貢獻(xiàn)最大，因處理后的血漿樣品中殘留的基質(zhì)成分在進(jìn)行LC-MS/MS分析時會對檢測響應(yīng)信號產(chǎn)生明顯的干擾，應(yīng)盡可能的優(yōu)化完善樣品的前處理方法、減少基質(zhì)干擾。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對低濃度測定結(jié)果的影響遠(yuǎn)大于高濃度，故需進(jìn)行加權(quán)線性擬合以保證低濃度測定的準(zhǔn)確性。血漿樣品的處理(回收率)及重復(fù)性(精密度)對低、中濃度不確定度貢獻(xiàn)均較大，故應(yīng)制定樣品前處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并對操作人員進(jìn)行充分培訓(xùn)并嚴(yán)格按規(guī)范操作。此外，儀器允差對各質(zhì)控濃度不確定度的貢獻(xiàn)也不容忽視，應(yīng)對儀器定期進(jìn)行核查、維護(hù)和計(jì)量檢定。根據(jù)不確定度評定結(jié)果，在實(shí)際分析測定過程中對不確定度貢獻(xiàn)較大的各分量來源應(yīng)加以關(guān)注和嚴(yán)格控制，找出影響因素和解決辦法，盡可能地減小不確定度，為測定方法提供科學(xué)指導(dǎo)并提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。