酸性土壤上花生高效根瘤菌的分離及應(yīng)用

劉鵬，田穎哲，鐘永嘉，廖紅

酸性土壤上花生高效根瘤菌的分離及應(yīng)用

劉鵬，田穎哲，鐘永嘉，廖紅

（福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院根系生物學(xué)研究中心，福州 350002）

花生（L.）是世界上重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。在我國(guó)南方產(chǎn)區(qū)，大部分花生種植地土壤為酸性。酸性土壤不僅pH值低、瘦瘠，而且還有低磷、鋁毒等諸多障礙因素，嚴(yán)重限制了花生的生物固氮及產(chǎn)量?！尽勘疚闹荚诜蛛x及應(yīng)用適應(yīng)酸性土壤的高效固氮根瘤菌，提高花生固氮效率及產(chǎn)量，改良酸性土壤。利用平板劃線結(jié)合鏡檢的方法，從田間采集的新鮮花生根瘤中分離純化單菌落；通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)分離物中是否含有結(jié)瘤基因和固氮基因，進(jìn)行根瘤菌的初步分子鑒定；再通過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)，對(duì)根瘤菌進(jìn)行進(jìn)一步分子鑒定。候選根瘤菌通過(guò)水培回接，檢測(cè)其與花生的共生結(jié)瘤及固氮能力；再通過(guò)田間試驗(yàn)評(píng)價(jià)篩選出來(lái)的候選根瘤菌在酸性土壤上的應(yīng)用效果。本研究首先從不同酸性土壤種植區(qū)域的花生根瘤中分離、純化得到256個(gè)分離物；其中10株含有和，初步確定為根瘤菌。經(jīng)16S rRNA基因全長(zhǎng)序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)8株為慢生型根瘤菌（），2株為根瘤菌屬根瘤菌（）。水培回接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這10株根瘤菌均能夠與花生共生、形成有效根瘤，證實(shí)是花生根瘤菌。在此基礎(chǔ)上，選取4株固氮效率較高的根瘤菌，在酸性土壤上應(yīng)用。結(jié)果表明，4株根瘤菌均能與花生在酸性土壤上形成根瘤，而未接種的花生根部不能形成根瘤。并且接種根瘤菌后顯著改善了花生氮營(yíng)養(yǎng)，提高了花生的生物量和產(chǎn)量。與不接種的對(duì)照相比，接種根瘤菌后，花生生物量、產(chǎn)量和氮含量分別提高了27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。本研究分離鑒定的花生根瘤菌能夠高效固氮和適應(yīng)酸性土壤，具有重要的應(yīng)用前景。

酸性土壤；花生；根瘤菌；生物固氮

0 引言

【研究意義】花生（L.），豆科花生屬，一年生草本植物，具有產(chǎn)量高、用途廣、抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，是世界上重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物[1]?；ㄉ鳛槎箍浦参?，能與根瘤菌共生形成根瘤進(jìn)行生物固氮[2]，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上優(yōu)良的輪作換茬和間套種作物，具有增加復(fù)種指數(shù)，改良土壤結(jié)構(gòu)、肥地養(yǎng)地等農(nóng)業(yè)生態(tài)功能[3]。近年來(lái)，我國(guó)花生供需矛盾日益彰顯，已成為全球花生的主要進(jìn)口國(guó)之一[4]。我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)以長(zhǎng)江流域?yàn)榻?，分為南方小花生區(qū)和北方大花生區(qū)[5]。其中南方產(chǎn)區(qū)的土壤主要為酸性土壤。篩選適應(yīng)酸性土壤的高效固氮根瘤菌，對(duì)提高南方花生產(chǎn)量，緩解我國(guó)花生供需矛盾及改良酸性土壤，具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，接種根瘤菌不僅能提高豆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能提高土壤微生物活性和多樣性，提高土壤肥力[6]。在國(guó)外，接種根瘤菌作為花生的主要栽培措施之一，已被大面積推廣應(yīng)用[7]。在我國(guó)，接種根瘤菌在湖北、山東等地的花生生產(chǎn)上也有使用，但面積較小[8]。接種根瘤菌對(duì)豆科作物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要取決于根瘤菌與作物的匹配性和固氮能力[9]。根瘤菌的生長(zhǎng)與活性受土壤理化性質(zhì)影響很大，北方豆科作物根瘤菌在南方酸性土壤適應(yīng)性較差，田間接種效果不明顯[10-11]。因此，想要提高豆科作物根瘤菌的實(shí)際應(yīng)用效果，需要篩選土壤中競(jìng)爭(zhēng)力和固氮能力較強(qiáng)，適應(yīng)范圍較廣的根瘤菌[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】酸性土壤不僅pH值低，而且土壤酸化加劇了鹽基離子如Ca2+、Mg2+等的淋溶，促進(jìn)了鋁、錳等元素的釋放，增強(qiáng)了磷的固定，造成氮、磷、鉀等養(yǎng)分匱缺，對(duì)作物生長(zhǎng)極為不利[13]。此外，土壤酸化還會(huì)限制豆科植物結(jié)瘤固氮。據(jù)報(bào)道，土壤pH值低于5.0時(shí)，大部分豆科作物無(wú)法正常結(jié)瘤[14]。在花生中，關(guān)于篩選適應(yīng)酸性土壤的高效根瘤菌及應(yīng)用鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從來(lái)自酸性土壤上不同種植區(qū)域的花生根瘤中，分離純化花生根瘤菌。通過(guò)水培回接和田間應(yīng)用驗(yàn)證，篩選出適應(yīng)酸性土壤的花生高效固氮根瘤菌，為配制適應(yīng)酸性土壤的花生高效根瘤菌提供理論依據(jù)和應(yīng)用材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試花生為閩花8號(hào)，福建農(nóng)林大學(xué)油料作物所莊偉健教授惠贈(zèng)。供試花生根瘤采自福建省安溪縣龍涓鄉(xiāng)（東經(jīng)117.80°，北緯24.95°）、福建省福安市天香茶園（東經(jīng)119.51°，北緯26.14°）、福建省尤溪縣洋中（東經(jīng)118.49°，北緯26.28°）。其中，安溪和福安采樣點(diǎn)無(wú)花生種植歷史，洋中采樣點(diǎn)連年種植花生。田間試驗(yàn)在安溪縣舉源茶葉合作社茶園進(jìn)行。土壤基本理化性質(zhì)如表1。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤樣品測(cè)定參照鮑士旦等方法[15]。pH：電位法（土﹕水=1﹕2.5，質(zhì)量比）；有機(jī)質(zhì)：高溫外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法；堿解氮：1 mmol?L-1NaOH堿解擴(kuò)散法；有效磷：BrayⅠ提取-鉬銻抗比色法；速效鉀：乙酸銨浸提-火焰光度法。

1.3 根瘤菌分離純化及分子鑒定

根瘤菌分離純化：參考賈立敏等方法[16]：挑取新鮮花生根瘤，用超純水沖洗5—7遍，95%乙醇溶液處理2.5 min；0.2% HgCl2溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗5—7次。用無(wú)菌刀片將消毒根瘤切為兩半，將根瘤切面在YMA培養(yǎng)基表面劃線，倒置封好，28℃恒溫培養(yǎng)。從第2天起，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，直至獲得純凈單菌落。

菌落分子鑒定：參照畢江濤等及李永春等[17-18]方法，利用和引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%凝膠電泳檢測(cè)初篩。再用16S rRNA基因通用引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物測(cè)序分析[19-20]（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

擴(kuò)增的反應(yīng)體系（以10 μL為例）：2×Mix酶5 μL，引物F/R（10 μmol·L-1）各0.2 μL，菌液1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)程序（表2）：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火30 s，60℃延伸30 s，40循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存PCR產(chǎn)物。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

表1 各采樣點(diǎn)土壤基本理化性質(zhì)

表2 根瘤菌分析鑒定所用的PCR引物

1.4 水培回接試驗(yàn)

低氮水培回接，營(yíng)養(yǎng)液配方如下（g·L-1）：Ca (NO3)2·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，CaCl2·2H2O 0.10 g，KH2PO40.10 g，Na2HPO4·12H2O 0.15 g，C6H5O7Fe·5H2O 0.005 g，微量元素1 mL，蒸餾水1000 mL，pH 5.8—6.0。微量元素配方（g·L-1）：H2MoO40.02 g，MnSO41.81 g，H3BO32.86 g，CuSO4·5H2O 0.8 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g。

根瘤菌培養(yǎng)：將-80℃保存的根瘤菌菌株，劃線并培養(yǎng)，后接種于YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃，200 r/min，培養(yǎng)至菌液OD600=1.2。

將胚根長(zhǎng)至3—5 cm的花生幼苗浸泡在根瘤菌菌液2 h進(jìn)行接種，再移至低氮營(yíng)養(yǎng)液中，在生長(zhǎng)室（日/夜：16 h/8 h，26℃/24℃）生長(zhǎng)30 d。本試驗(yàn)包括分別接種10株不同根瘤菌與不接種處理，4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共44盆。收獲后，測(cè)定植株生物量、結(jié)瘤數(shù)、含氮量和固氮酶活性等。參照艾文琴等[21]，利用乙炔還原法測(cè)定花生根瘤固氮酶活性。

1.5 田間試驗(yàn)

根瘤菌田間試驗(yàn)：在水培試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取固氮能力較強(qiáng)4株根瘤菌（AXLQ1-6，F(xiàn)AMB12-6，YZMB13-3和YZMO14-4），在酸性土壤上進(jìn)行田間試驗(yàn)，以不接種為對(duì)照。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)。每小區(qū)長(zhǎng)30 m、寬0.8 m，共24 m2。花生株行距為0.30 m×0.15 m，每小區(qū)種植花生400株。播種前施鈣鎂磷肥75 kg·hm-2。雜草、病蟲(chóng)害控制等按照花生田間日常管理執(zhí)行。在開(kāi)花期和成熟期進(jìn)行取樣：種植45 d后（即開(kāi)花期），每根瘤菌菌種，每小區(qū)取代表性植株10株，共30株測(cè)定葉片SPAD值、地上部生物量、氮含量、根瘤個(gè)數(shù)等指標(biāo)。種植110 d后（即成熟期），進(jìn)行小區(qū)測(cè)產(chǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：選取具有較高同源性、已發(fā)表根瘤菌序列為參比菌株序列，利用BioEdit軟件對(duì)供試菌株和參比菌株序列進(jìn)行16S rRNA基因序列的多序列自動(dòng)比對(duì)，再利用Mega 7.0軟件，采用Kimura-2參數(shù)，進(jìn)行鄰接法（Neighbor- Joining）分析，生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

試驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2014（Microsoft Company，美國(guó)）和SPSS 18.0（Statistical Product and Service Solutions，美國(guó)）等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SigmaPlot 12.0（Systat Software，美國(guó)）進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 酸性土壤上花生根瘤菌的分離純化與分子鑒定

利用平板劃線法，從花生根瘤中共分離出256個(gè)分離物。利用引物和引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR目的片段擴(kuò)增，1%凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。結(jié)瘤基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)生750 bp左右的條帶，固氮基因擴(kuò)增產(chǎn)生450 bp左右的條帶。通過(guò)和PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，256個(gè)分離物中，有10個(gè)分離物同時(shí)含有和，初步預(yù)測(cè)這些菌株具有固氮結(jié)瘤潛力（圖1）。

1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分別代表根瘤菌AXLQ1-6，AXLQ1-7，YZHO5-5，F(xiàn)AMB12-6，YZMB13-3，YZHO13-7，F(xiàn)AMB13-9，YZLH14-3，YZMO10-8，YZMO14-4，CK

將上述10株候選花生根瘤菌的16S rRNA基因序列，與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的6株參比菌株的序列，進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖 2）。從進(jìn)化與發(fā)育關(guān)系來(lái)看，本研究獲得的根瘤菌主要分為兩大類(lèi)，其中8株屬于慢生型根瘤菌屬（），2株屬于根瘤菌屬（）。8株慢生型根瘤菌，包括菌株YZMB13-3、AXLQ1-7、YZMO14-4、YZLH14-3、YZHO5-5、FAMB12-6、YZHO13-7、FAMB13-9與參比慢生型根瘤菌SEMIA6396、MN-139聚在一起。2株根瘤菌屬根瘤菌，AXLQ1-6和YZMO10-8，與根瘤菌屬的參比菌株strain G2312和strain5502G聚在一起，說(shuō)明了根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬菌株都具有與花生共生形成根瘤的潛力。

2.2 根瘤菌在水培試驗(yàn)中與花生的結(jié)瘤固氮能力

將上述根瘤菌進(jìn)行水培回接，檢驗(yàn)其與花生共生結(jié)瘤及固氮的能力。結(jié)果表明，所有供試根瘤菌均能與花生共生形成根瘤，而不接種處理的花生植株不能形成根瘤。其中，接種處理每株花生平均結(jié)瘤數(shù)為11—39個(gè)（表3）。與對(duì)照相比，結(jié)瘤植株生物量、SPAD值變化不顯著，但大部分植株含氮量顯著增加，高于對(duì)照43.2%—507.7%（表3）。表明本研究分離鑒定的10株根瘤菌，確實(shí)具有與花生共生，形成根瘤以及固氮的能力。

①慢生型根瘤菌屬，②根瘤菌屬，③葡萄球菌屬。各參比菌株后面括號(hào)里是 16S rRNA 基因全序列在基因庫(kù)中的登錄號(hào)

表3 水培試驗(yàn)中接種不同根瘤菌對(duì)花生結(jié)瘤及生長(zhǎng)的影響

表中的數(shù)據(jù)為 4次重復(fù)的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。*表示同一性狀接種根瘤菌植株與對(duì)照的Student檢驗(yàn)結(jié)果。*：0.01＜＜0.05；**：0.001＜＜0.01；***：＜0.001

The data in the table were the mean ± standard error (n=4). *, **, *** present the significant differences between inoculated with and without rhizobium stain through Student-test for the same trait at 0.01＜＜0.05, 0.001＜＜0.01 and＜0.001 level, respectively

根瘤固氮酶活性測(cè)定結(jié)果表明，所有供試根瘤菌與花生形成的根瘤，均具有固氮酶活性。但不同根瘤菌所形成的根瘤，固氮酶活性差異顯著。最高可達(dá)28 μmol (C2H4)·g-1(FW)·h-1，最低僅為0.3 μmol (C2H4)·g-1(FW)·h-1（圖3），差異近100倍，說(shuō)明了不同的花生根瘤菌之間的固氮能力差異明顯。

2.3 花生高效根瘤菌在酸性土壤上田間應(yīng)用效果

在水培試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取4株固氮酶活性較高的根瘤菌進(jìn)行大田應(yīng)用。結(jié)果表明，所選的4株根瘤菌在田間都能與花生正常結(jié)瘤，并促進(jìn)花生生長(zhǎng)（表4）。供試根瘤菌在酸性土壤上，與花生具有較強(qiáng)共生結(jié)瘤能力。表現(xiàn)在接種后不僅結(jié)瘤率100%，而且單株結(jié)瘤數(shù)高達(dá)69—195個(gè)（表4），不接種的對(duì)照植株不能形成根瘤。此外，接種不同根瘤菌均能顯著促進(jìn)花生生長(zhǎng)、提高花生植株生物量。接種后所形成的根瘤固氮酶活性在1.8—6.0 μmol C2H4·g-1·h-1之間。其中，來(lái)自低氮土壤的根瘤菌FAMB12-6固氮酶活性較高，而篩選自高氮土壤的根瘤菌AXLQ1-6固氮酶活性較低（表1，圖4）。與對(duì)照相比，接種4種不同根瘤菌，分別提高了花生生物量33.6%、37.7%、38.0%和27.1%（表4）。

圖中的數(shù)據(jù)為 3 次重復(fù)的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。***：?jiǎn)我蛩胤讲罘治霾町悩O顯著，P＜0.001。不同小寫(xiě)字母表示不同根瘤菌處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平

表4 田間接種不同根瘤菌對(duì)花生結(jié)瘤及生長(zhǎng)的影響

表中的數(shù)據(jù)為30株苗的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異達(dá)0.05顯著水平

The data in the table were mean ± standard error (n=30). Different letters indicated significantly different at 0.05 level

圖中的數(shù)據(jù)為 10 次重復(fù)的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。***：?jiǎn)我蛩胤讲罘治霾町悩O顯著，P＜0.001。不同字母表示不同根瘤菌處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平

此外，接種根瘤菌顯著改善了花生氮營(yíng)養(yǎng)、提高花生產(chǎn)量。SPAD值是衡量植株葉綠素含量的重要指標(biāo)，SPAD值的高低可間接體現(xiàn)植物氮營(yíng)養(yǎng)的高低。接種根瘤菌顯著提高了花生葉片的SPAD值，其中接種根瘤菌YZMB13-3，對(duì)花生SPAD值提高較為明顯，提高了28.7%（表4，圖5）。與對(duì)照相比，接種根瘤菌顯著改善了花生氮營(yíng)養(yǎng)。尤其是接種YZMB13-3后，植株氮含量增加了151.0%（表4，圖5）。接種根瘤菌后，花生產(chǎn)量也顯著增加。接種根瘤菌FAMB12-6對(duì)花生增產(chǎn)最為明顯，增幅為104.2%（表4，圖5）。接種根瘤菌促進(jìn)花生增產(chǎn)主要原因?yàn)樵黾訂沃杲Y(jié)莢數(shù)（表4，圖5）。

圖5 酸性土壤條件下接種YZMB13-3根瘤菌對(duì)花生生長(zhǎng)的影響

3 討論

3.1 酸性土壤上花生根瘤菌的發(fā)現(xiàn)及意義

我國(guó)南方土壤主要為酸性土壤，南方土壤由于自然發(fā)育、酸沉降、淋溶作用造成土壤pH值低，且土壤中可供植物利用的氮、磷、鉀、鎂等元素嚴(yán)重缺乏，不利于作物生長(zhǎng)[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌可顯著提高豆科作物的抗逆性，還可提高土壤養(yǎng)分利用率[18]。因此在酸性土壤上種植花生，在選擇耐酸性花生種質(zhì)的同時(shí)，還要利用適應(yīng)酸性土壤和花生匹配的花生根瘤菌[23]。接種花生根瘤菌作為提高花生產(chǎn)量的重要策略，在20世紀(jì)60年代已有報(bào)道[24]。但是國(guó)內(nèi)大部分的研究主要集中在華北、華中以及西北地區(qū)的花生根瘤菌，但對(duì)華南地區(qū)酸性土壤花生根瘤菌的研究較為少見(jiàn)[25]。本研究在連續(xù)種植以及未種植花生的華南地區(qū)酸性土壤上，利用田間、盆栽的方式通過(guò)分離、鑒定得到具有結(jié)瘤固氮功能的花生根瘤菌（表1，圖2）。與之前報(bào)道的篩選自中性或堿性土壤的花生根瘤菌相比，具有耐酸的特性。同時(shí)本研究利用了多個(gè)花生品種對(duì)花生根瘤菌進(jìn)行捕捉，利用水培與田間試驗(yàn)對(duì)根瘤菌進(jìn)行根瘤固氮能力的篩選，最終得到固氮效率高、競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)和適應(yīng)性廣的花生根瘤菌（表3，表4，圖4）。本研究分離得到的花生根瘤菌應(yīng)用于南方酸性土壤中不僅可以改善宿主植株的氮營(yíng)養(yǎng)，還可以提高花生產(chǎn)量，提高土壤氮素，培肥地力，減少肥料應(yīng)用，改善生態(tài)環(huán)境，具有重要的應(yīng)用前景。

3.2 花生根瘤菌的宿主范圍及土壤適應(yīng)性

根瘤菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，在土壤中分布廣泛。有報(bào)道指出，根瘤菌受環(huán)境脅迫和宿主植株選擇的影響，向著不同方向進(jìn)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演變與進(jìn)化形成表型和遺傳基因的高度多樣性[26]。細(xì)菌是一種生命活體，對(duì)生存環(huán)境的要求比較高。因此，不同的根瘤菌在不同土壤的生長(zhǎng)狀況也不盡相同。據(jù)報(bào)道，一般根瘤菌在中性或中堿性的土壤中結(jié)瘤固氮效果最好，而在酸性土壤中效果較差[27]。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究篩選到的花生根瘤菌在土壤pH為5.1時(shí)，還能正常結(jié)瘤固氮、促進(jìn)花生植株生長(zhǎng)（表4，圖5），說(shuō)明其具有較好的適應(yīng)酸性土壤的能力。究其原因，本研究在篩選根瘤菌時(shí)，同時(shí)兼顧到根瘤菌土壤環(huán)境和宿主種類(lèi)兩個(gè)方面。在土壤環(huán)境方面，根瘤菌來(lái)自pH值為4.2—5.1的3種典型酸性土壤，氮磷含量差異較大的土壤類(lèi)型，以及不同的花生種植歷史。本研究所得菌株可初步劃分為根瘤菌屬和慢生型根瘤菌屬。與劉璐等人研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，豆科植物長(zhǎng)期共生的根瘤菌具有高度區(qū)域特異性[28]。本研究中有6株根瘤菌菌株主要來(lái)自洋中（圖2），說(shuō)明相對(duì)其他的取樣地點(diǎn)（安溪、福安）長(zhǎng)期種植花生的洋中土壤中，花生土著根瘤菌可能具有較高的豐富度。因此，獲得的花生根瘤菌類(lèi)型較廣泛，可以應(yīng)對(duì)不同的環(huán)境類(lèi)型。根瘤固氮酶活性受土壤含氮量影響較大，土壤的含氮量較高，根瘤菌的固氮酶活性受到抑制[29]。如本研究田間試驗(yàn)中，由福安較低含氮量的土壤篩選到的根瘤菌表現(xiàn)較高固氮酶活性，而篩選自安溪含氮量較高的土壤的根瘤菌則固氮酶活性較低（表1，圖4）。并且，來(lái)自于洋中的根瘤菌YZMB13-3所形成根瘤最多，可能為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)菌株，競(jìng)爭(zhēng)能力較強(qiáng)（表4）。

在宿主方面，為了提高研究分離得到的根瘤菌菌株具有較廣宿主適應(yīng)性，本研究采用來(lái)自18種不同花生的根瘤作為根瘤菌的來(lái)源。此外，田間應(yīng)用的根瘤菌菌株是通過(guò)分子鑒定和水培回接試驗(yàn)的層層篩選，選取固氮酶活性較高的菌株，具有較強(qiáng)的固氮效率。因此，本研究所獲得的根瘤菌，具有可以適應(yīng)酸性土壤、宿主范圍廣和固氮效率較高的特點(diǎn)。

3.3 花生高效根瘤菌在酸性土壤上的應(yīng)用前景

氮是植物生長(zhǎng)必需大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，植物生長(zhǎng)對(duì)氮的需要量較大。氮素供應(yīng)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上限制作物產(chǎn)量的重要因素之一?；ㄉ鷮俣箍浦参?，花生與花生根瘤菌通過(guò)有效的共生固氮作用可為提供花生整個(gè)生育期所需氮素的50%以上[30]。本研究結(jié)果表明，接種花生根瘤菌可以顯著提高花生植株生物量，增強(qiáng)花生對(duì)酸性土壤的適應(yīng)性。這一結(jié)果和目前許多報(bào)道通過(guò)接種根瘤菌提高宿主植物的耐受逆境的能力是一致的。例如，接種根瘤菌或者其他微生物可以顯著提高宿主植物對(duì)逆境的適應(yīng)，比如鹽堿，干旱等[29, 31-32]。并且程鳳嫻等在研究中發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌不僅增加了大豆植株氮含量，也增加了植株磷含量[23]?？梢?jiàn)，接種根瘤菌也可促進(jìn)豆科作物對(duì)其他的養(yǎng)分吸收，從而提高產(chǎn)量。這與本研究發(fā)現(xiàn)一致，在酸性土壤上接種根瘤菌，不僅可以通過(guò)生物固氮為花生提供氮素，還可促進(jìn)花生的生殖生長(zhǎng)（單株結(jié)莢數(shù)顯著增加，表4）。

目前，我國(guó)土壤酸化越來(lái)越嚴(yán)重。以福建省為例，其耕地土壤酸化面積占總面積66.47%[33]。鋁毒、低磷、低氮是酸性土壤上限制豆科作物產(chǎn)量的重要因素。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，需要施加大量的復(fù)合肥來(lái)提高土壤的氮、磷養(yǎng)分水平，這也是造成土壤進(jìn)一步酸化，破壞自然生態(tài)的主要原因[34]。此外，酸性土壤地區(qū)豆科作物種植比較少，土壤中土著根瘤菌豐度較低。人工接種根瘤菌是提高豆科作物固氮能力和產(chǎn)量主要措施之一[35]。本研究結(jié)果表明，在未種植過(guò)花生的酸性土壤上，如果不接種根瘤菌，花生基本沒(méi)有根瘤，進(jìn)一步說(shuō)明酸性土壤中能與花生匹配共生的根瘤菌非常少。接種根瘤菌后，不僅能夠形成具有固氮功能的根瘤，還能促進(jìn)花生生長(zhǎng)，顯著提高花生生物量以及植株含氮量，最終增加花生產(chǎn)量（表4，圖5）。說(shuō)明接種高效根瘤菌確實(shí)是提高花生對(duì)酸性土壤的適應(yīng)性，最終提高花生產(chǎn)量的有效措施。

4 結(jié)論

本研究分離、純化并鑒定了酸性土壤上的10株花生高效根瘤菌。這些根瘤菌分別屬于慢生型根瘤菌與根瘤菌屬根瘤菌；在水培條件下，與花生共生，形成具有高效固氮的根瘤；進(jìn)一步選取4株結(jié)瘤固氮能力較強(qiáng)的根瘤菌進(jìn)行田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些高效根瘤菌都能顯著促進(jìn)酸性土壤上花生的生長(zhǎng)，可分別提高花生生物量、產(chǎn)量和含氮量27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。因此本研究分離鑒定的花生根瘤菌能夠適應(yīng)酸性土壤和高效固氮，具有重要的應(yīng)用前景。

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Isolation and Application of EffectiveStrains in Peanut on Acidic Soils

LIU Peng, TIAN YingZhe, ZHONG YongJia, LIAO Hong

(Root Biology Center, College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

【】Peanut (L.) is an important oil and economic crop in the world. Most of the peanut cultivation soils in South China are acidic. Since low pH value, nutrition deficiencies and aluminium (Al) toxicity on acidic soils severely limit yield and biological nitrogen fixation (BNF) capacity in peanut. 【】The purpose of this paper is to isolate acidic soil adaptivestains to improve BNF and yield of peanut, as well as to remediate acidic soils.【】Firstly, strains were isolated and purified from fresh peanut nodules by collecting from the field by streak plate method combined with microscope observation, the nodulation geneand nitrogen fixing genewere detected by PCR to preliminary identification of potentialstrains, and then 16S rRNA sequencing was used for further taxonomy identification of the isolate strains. The symbiotic nodulation and nitrogen fixation ability of potentialstrains were validated by inoculation to the peanut under hydroponics conditions. Further, the candidate rhizobium strains in the field trial on acidic soils were evaluated. 【】 A total of 256 microbe strains were isolated and purified from nodules of peanuts grown in different sites on acidic soils. Based on the results of 16S rRNA sequencing analysis, ten of them containedand, and were initially identified as potential. Of which, 8 strains belonged tosp. and 2 belonged tosp. Hydroponic experiments further confirmed that the 10 strains could form functional nodules with peanuts. Subsequently, 4 strains with higher BNF capacity were selected for field evaluation on acidic soils. The results showed that all the 4 strains successfully formed functional nodules with peanuts in the field. On contrary, none of nodules could be formed in peanuts without rhizobium inoculation. Besides,inoculation significantly improved N nutrition, and increased biomass and yield of peanut. By comparison with CK plants, biomass, yield and N content of peanuts inoculated withstrains were increased by 27.1%-38.0%, 24.7%-104.2% and 73.9%-151.3%, respectively. 【】Taken together, the peanutisolated and identified in this study could fix N2effectively and adapted well to acidic soils, and therefore which had great application potentials.

acidic soils; peanut; rhizobia; biological nitrogen fixation

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.010

2019-03-25；

2019-06-04

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0100700）

劉鵬，E-mail：448860600@qq.com。

廖紅，E-mail：hliao@fafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）