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    耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌同源性及生物膜形成能力分析

    2019-10-12 02:01:28趙永鑫王曉紅郭宇航范學(xué)財包名家張曉麗
    微生物學(xué)雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:佳木斯大學(xué)鮑曼青霉

    趙永鑫 ,王曉紅,王 英,郭宇航,范學(xué)財,王 勇,包名家,張曉麗*

    (1.佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗科,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗科,黑龍江 佳木斯 154003;3.佳木斯市疾病預(yù)防控制中心,黑龍江 佳木斯 154000)

    鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是醫(yī)院主要的條件致病菌[1]。由于碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用,近年來,耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(Carbapenem ResistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)在世界范圍蔓延的報道屢見不鮮[2]。細菌生物膜存在于各種物體表面,幾乎所有的細菌都具有形成生物膜的能力。鮑曼不動桿菌在48 h內(nèi)就能夠形成成熟的生物膜,其相關(guān)感染最常見的就是醫(yī)療設(shè)備感染[3],特別是醫(yī)院入侵設(shè)備,如機械通氣、氣管插管等。生物膜的形成在一定程度上促進了菌株在醫(yī)院環(huán)境中的定殖、播散、流行。本研究通過MLST及ERIC-PCR分析佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB的分子分型及同源性,通過對比分析CRAB與碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌(Carbapenem-sensitiveAcinetobacterbaumannii,CSAB)生物膜形成能力,討論生物膜形成與碳青霉烯類耐藥性獲得的相關(guān)性,為控制其交叉感染和傳播提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株來源 收集2013至2014年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離CRAB 35株,剔除重復(fù)菌株,采用VITEK II全自動細菌鑒定儀對菌株鑒定并進行體外敏感實驗,E-test法測定亞胺培南和美羅培南。篩選菌株于-80 ℃保存?zhèn)溆?,根?jù)簡單隨機抽樣原則從CSAB中選取38株作為生物膜形成能力分析的對比菌株。

    1.1.2 主要試劑 PCR-MⅨ購自promega corporation USA,結(jié)晶紫購自珠海貝索生物有限公司,E-test試紙條購自鄭州安圖生物股份有限公司,7對管家基因及ERIC引物核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 MLST 煮沸法制備DNA模板。PCR 擴增7個管家基因https://pubmlst.org/abaumannii/info/primers_Pasteur.shtml,序列見表1。PCR反應(yīng)條件為 94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行電泳,100 V 50 min,PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序。序列分析使用Pasteur MLST 將測序后序列輸入網(wǎng)站(http://pubmlst.org/abaumannii/)進行序列查詢,最終確定ST型。

    表1 管家基因引物序列Table 1 Housekeeping gene primer sequences

    1.2.2 ERIC 引物ERIC-2 (AAGTAAGTGACTGG-GGTGAGCG),PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,40 ℃ 1 min,65 ℃ 8 min,30個循環(huán);65 ℃ 6 min。

    1.2.3 結(jié)晶紫染色法生物被膜形成能力定量分析 取單個菌落于4 mL LB肉湯120 r/min 培養(yǎng)18 h;生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?6孔板加入200 μL肉湯,實驗菌液10 μL,4復(fù)孔,35 ℃培養(yǎng)24 h;PBS緩沖液沖洗3次;加入1∶10稀釋的甲醛200 μL固定15 min;200 μL結(jié)晶紫染色15 min;去離子水沖洗,200 μL無水乙醇輕微震蕩10 min,570 nm處讀取吸光值,重復(fù)3次,取均值為該菌株最終D值。生物被膜形成能力定量判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]:測定陰性對照(LB肉湯)吸光值N,平均N+3S定義為Dc,將待測菌株D值與Dc進行比較:陰性(-):D≤Dc;弱陽性(1+):Dc4Dc。

    1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS2.0統(tǒng)計軟件,Kruskal-Wallis秩和檢驗比較CRAB與CSAB生物被膜形成能力,組間多重比較采用Bonferroni方法進行校正。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ICU鮑曼不動桿菌檢出率

    2014至2017年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU檢出耐鮑曼不動桿菌189株,CRAB的檢出率從2014年的92.00%降低至2017年的11.39%(表2)。

    表2 2014至2017年ICU患者檢出鮑曼不動桿菌及CRAB檢出率(%)Table 2 Detection of Acinetobacter baumannii (%)and CRAB (%)in ICU patients in 2014-2017

    2.2 藥敏實驗結(jié)果

    CRAB除復(fù)方新諾明(17.14%)、妥布霉素(2.86%)、左氧氟沙星(36.36%)、頭孢哌酮/舒巴坦(91.30%)、替加環(huán)素(100%)以外,其余全部耐藥,CSAB對14種抗生素的敏感率均大于80.00%,具體見表3。

    2.3 耐藥基因攜帶結(jié)果

    CRAB攜帶OXA類酶情況,結(jié)果如表4所示。部分樣本多重PCR電泳結(jié)果見圖1。

    2.4 MLST及ERIC結(jié)果

    在檢測的35株CRAB中,33株ST 2型,是佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院主要流行克隆型,主要分離于ICU(16/35)和急診(9/35),分離樣本主要是痰液(80.82%)。ST 671型也被發(fā)現(xiàn),在將測序結(jié)果拼接比對時,發(fā)現(xiàn)1株新型,將其命名為ST 1199型,見表4。ERIC-PCR 結(jié)果顯示分為A、B、C、D四型,A型9株,B型24株,C型1株,D型1株。部分電泳圖結(jié)果見圖2。

    表3 CRAB與CSAB的藥敏分析Table 3 Susceptibility analysis of CRAB and CSAB

    圖1 blaOXA-23、blaOXA-51和blaOXA-24多重PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of blaOXA-23,blaOXA-51 and blaOXA-24 by multiple PCR M:1 500 bp Marker;OXA-23(73,142);OXA-51(22,73,85,86,142);OXA-24(22)

    圖2 部分菌株 ERIC-PCR 圖譜Fig.2 The partial result of genotyping by using ERIC-PCR method M:Marker(bp);70:A型;111、114、116、118、122、126、131、132:B型;77:C型;125:D型

    表4 碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的分子特征及耐藥基因Table 4 Molecular characteristics and drug resistance genes of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

    注:ERIC為腸道細菌基因重復(fù)序列;MLST為多序列位點分型;“+”為存在耐藥基因;“-”為不存在耐藥基因

    2.5 生物被膜檢測結(jié)果

    對73株臨床分離的CRAB與CSAB進行生物膜形成能力的定性分析,檢測結(jié)果見表5,判定標(biāo)準(zhǔn)如前所述。統(tǒng)計分析結(jié)果提示佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB組總體上生物膜形成能力較CSAB組下降(0.330±0.258、0.534±0.402,Z=2.843,P=0.004),提示碳青霉烯類耐藥性的獲得可導(dǎo)致生物膜形成能力的下降。

    表5 CRAB與CSAB生物膜形成能力定性分布Table 5 Qualitative distribution of CRAB and CSAB biofilm formation capacity

    2.6 blaOXA基因攜帶與生物膜形成能力的相關(guān)性

    根據(jù)OXA酶攜帶情況,分為3組,1組代表blaOXA-23(-)blaOXA-51(+),2組代表blaOXA-23(+)blaOXA-51(+),3組代表blaOXA-24(+),4組為CSAB對照組,其生物膜形成能力見圖3,圖中的點是各菌株生物膜吸光度的平均值,每組的均值已經(jīng)列出。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示CRAB生物膜形成能力與3種耐藥基因攜帶情況均無明顯相關(guān)性(P=0.369),具體見表6。

    表6 blaOXA基因與生物膜形成能力的相關(guān)性Table 6 Correlation of blaOXA gene with biofilm formation ability

    圖3 CRAB與CSAB生物膜形成能力Fig.3 Biofilm formation in the CRAB and CSAB

    3 討 論

    鮑曼不動桿菌耐藥機制復(fù)雜,除了其固有的抗藥性外,還可以獲得抗藥基因,包括產(chǎn)碳青霉烯酶,外膜孔蛋白缺失,青霉素結(jié)合位點改變,外排泵的高度表達,生物膜的形成等。碳青霉烯酶是指能夠水解至少一種碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶。Ambler分類包括A、B、D類酶。碳青霉烯水解D類β-內(nèi)酰胺酶(CHDLs),也稱為苯唑西林酶(OXA),是在鮑曼不動桿菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)廣泛的β-內(nèi)酰胺酶。已鑒定出6個群,包括OXA-51-like、OXA-23-like、OXA-40/24-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-48-like[5]。佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的D類酶為blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-24,其主要的耐藥機制是產(chǎn)blaOXA-23[6],這一發(fā)現(xiàn)與俄羅斯和中東地區(qū)的結(jié)果相似[7-8]。有報道稱blaOXA-23的攜帶可以增加CRAB在醫(yī)院暴發(fā)的風(fēng)險因素[9]。

    分子流行病學(xué)在監(jiān)測CRAB的流行及暴發(fā)感染方面具有重要的作用。鮑曼不動桿菌臨床分離株MLST的種群結(jié)構(gòu)由I、II和Ⅲ的三個國際克隆譜系組成,CC1(ST 1、ST 7、ST 8、ST 19和ST 20),CC2(ST 2、ST 45和ST 47),CC3(ST 3和ST 14),大多數(shù)暴發(fā)菌屬于CC1和CC2[10]。ST 2型是世界上鮑曼分布最廣的ST型[11],對于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院ST 2型的暴發(fā),與我國安徽地區(qū)報道分型一致,意大利也有對于ST 2型院內(nèi)暴發(fā)的報道[12-13],說明本地區(qū)與世界流行克隆具有同源性。有研究發(fā)現(xiàn)[14],ST 2型與OXA類酶(OXA-23或OXA-24)有關(guān),這與本研究結(jié)果一致。從2014年起,佳木斯附屬第一醫(yī)院采取合理措施對可能的影響因素進行控制,例如:醫(yī)院內(nèi)空氣、地面、機器設(shè)備進行徹底消毒處理;醫(yī)務(wù)人員嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)章制度,取得了初步成效。由此可見,造成ST 2型在醫(yī)院暴發(fā)的最可能影響因素為醫(yī)務(wù)人員的消毒意識不足,其次在ICU中多為免疫力低下的患者,增加了感染概率。

    細菌生物膜是指細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面,由細菌自身分泌的胞外多糖基質(zhì)組成的細菌群體,是水平基因轉(zhuǎn)移的極好環(huán)境,可導(dǎo)致耐藥基因的獲得[15]??量虠l件下,在生物膜群落內(nèi)會使耐藥基因水平轉(zhuǎn)移并選擇出形成能力高的菌株。臨床分離的鮑曼不動桿菌幾乎都有形成生物膜的能力,其檢測主要分為定性法和定量法,本研究采用標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板法,通過測量結(jié)晶紫的吸光度,定量檢測生物膜的含量??股啬退幣c生物膜形成是CRAB在醫(yī)院流行的主要原因[16]。生物膜使鮑曼不動桿菌適應(yīng)惡劣的環(huán)境,抑制抗生素對細菌的殺滅作用,使CRAB引起的感染在臨床中很難治愈。有研究發(fā)現(xiàn)[17],菌毛合成系統(tǒng)、BfmRS雙組分調(diào)控系統(tǒng)、細菌QS、生物膜相關(guān)蛋白(Bap)及外膜蛋白都對鮑曼不動桿菌生物膜的形成有影響。本研究中,CRAB生物膜形成力相對弱于CSAB組,與Babapour等[18]的報道一致,且與blaOXA攜帶情況無明顯相關(guān)性。由于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB菌株較少,且主要克隆流行ST 2型,所以無法全面分析各ST分型在生物膜形成能力上的區(qū)別。另外,生物膜作為重要的毒力因素,沒有對鮑曼不動桿菌的致病力和毒力進行分析,需要進一步研究。

    總之,這是佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院首次對于CRAB流行病學(xué)情況進行分析與研究,生物膜的形成與院感密切相關(guān)。針對醫(yī)院ST 2型CRAB的暴發(fā),應(yīng)該在合理應(yīng)用治療藥物同時,加強嚴格消毒的意識,特別是在進行侵入性操作時,應(yīng)切斷交叉感染途徑,降低院內(nèi)感染暴發(fā)的風(fēng)險。

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